細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(WST-1法)-上海撫生實(shí)業(yè)有限公司

貨號(hào)	FS-X9529

中文名稱：細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(WST-1法)

英文名稱：WST-1 Cell Proliferation and Cytotoxicity Assay Kit

產(chǎn)品規(guī)格：100次|500次

貨號(hào)：FS-X9529

產(chǎn)品介紹:

本試劑盒是一種廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速高靈敏度檢測(cè)試劑盒。WST-1是一種類似于MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的formazan(參考下圖)。細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。

WST-1是MTT的一種升級(jí)替代產(chǎn)品，和MTT或其它MTT類似產(chǎn)品如XTT、MTS等相比有明顯的優(yōu)點(diǎn)。首先，MTT被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成的formazan不是水溶性的，需要有特定的溶解液來溶解；而WST-1和XTT、MTS產(chǎn)生的formazan都是水溶性的，可以省去后續(xù)的溶解步驟。其次，WST-1產(chǎn)生的formazan比XTT和MTS產(chǎn)生的formazan更易溶解。再次，WST-1比XTT和MTS更加穩(wěn)定，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加穩(wěn)定。另外，WST-1和MTT、XTT等相比，線性范圍更寬，靈敏度更高(參考下圖)。

本試劑盒可以用于細(xì)胞因子等誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖檢測(cè)，也可以用于抗癌藥物等對(duì)細(xì)胞有毒試劑誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性檢測(cè)，或一些藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制檢測(cè)等。

本試劑盒檢測(cè)非常便捷。無(wú)須使用同位素，所有的檢測(cè)步驟僅在同一塊96孔板內(nèi)完成。不必洗滌細(xì)胞，不必收集細(xì)胞，也不必采用額外步驟去溶解formazan?？梢杂糜诖笈繕悠返臋z測(cè)。

酚紅和血清對(duì)本試劑盒的測(cè)定無(wú)明顯影響。WST-1對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性。加入WST-1顯色后，可以在不同時(shí)間反復(fù)用酶標(biāo)儀讀板，使檢測(cè)時(shí)間更加靈活，便于找到佳測(cè)定時(shí)間。

注意事項(xiàng)：

由于使用96孔板進(jìn)行檢測(cè)，如果細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，一定要注意蒸發(fā)的問題。一方面，由于96孔板周圍一圈容易蒸發(fā)，可以采取棄用周圍一圈的辦法，改加PBS，水或培養(yǎng)液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培養(yǎng)箱內(nèi)水源的地方，以緩解蒸發(fā)。

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無(wú)菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個(gè)平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時(shí)；

4．將經(jīng)過計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時(shí)，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無(wú)菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大小；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度（如無(wú)570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測(cè)試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無(wú)細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無(wú)細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對(duì)照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)

肝素酶2(HPA2)檢測(cè)試劑盒 forHeparanase2(HPA2)

磷酸烯醇式酸羧激酶1(PCK1)檢測(cè)試劑盒 forPhosphoenolpyruvateCarboxykinase1,Soluble(PCK1)

干擾素γ(IFNγ)檢測(cè)試劑盒 forInterferonGamma(IFNg)

多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(DAT)檢測(cè)試劑盒 forDopamineTransporter(DAT)

中間α-球蛋白抑制因子H5(ITIH5)檢測(cè)試劑盒 forInterAlpha-GlobulinInhibitorH5(ITIH5)

巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶3(FUT3)檢測(cè)試劑盒 forFucosyltransferase3(FUT3)

血紅蛋白(HB)檢測(cè)試劑盒 forHemoglobin(HB)

銅伴侶超氧化物歧化酶(SOD4)檢測(cè)試劑盒 forSuperoxideDismutase,CopperChaperone(SOD4)

B-細(xì)胞淋巴瘤因子10(Bcl10)檢測(cè)試劑盒 forB-CellCLL/Lymphoma10(Bcl10)

5-羥色胺受體1A(HTR1A)檢測(cè)試劑盒 for5-HydroxytryptamineReceptor1A(HTR1A)

葡萄糖苷酸酶β(GUSβ)檢測(cè)試劑盒 forGlucuronidaseBeta(GUSb)

膜聯(lián)蛋白A4(ANXA4)檢測(cè)試劑盒 forAnnexinA4(ANXA4)

酸脫氫酶β(PDHβ)檢測(cè)試劑盒 forPyruvateDehydrogenaseBeta(PDHb)

Codanin1蛋白(CDAN1)檢測(cè)試劑盒 forCodanin1(CDAN1)

Cornulin蛋白(CRNN)檢測(cè)試劑盒 forCornulin(CRNN)

纖維蛋白原α(FGα)檢測(cè)試劑盒 forFibrinogenAlpha(FGa)

FMS樣氨酸激酶3(Flt3)檢測(cè)試劑盒 forFMSLikeTyrosineKinase3(Flt3)
細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(WST-1法)氨苯丁酯標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Butamben

羥苯丙酯標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Propylparaben

伐他汀鈉標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:350mg 英文名稱：Fluvastatin Sodium

拉西泮相關(guān)物質(zhì)C標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:25mg 英文名稱：Lorazepam Related Compound C

丙沙星甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:125mg 英文名稱：Ciprofloxacin Formamide

美脲標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Glimepiride

胺太林相關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:50mg 英文名稱：

萬(wàn)拉法新相關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:10mg 英文名稱：

愈創(chuàng)酚甘油醚標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Guaifenesin

諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Enrofloxacin

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