Caspase-8活性測定試劑盒-上海撫生實業(yè)有限公司

貨號	FS-X9734

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時；

4．將經(jīng)過計數(shù)的細胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當貼壁細胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進行快速固定以及免疫細胞化學檢測。

中文名稱：Caspase-8活性測定試劑盒

英文名稱：Caspase-8 Activity colorimetric assay Kit

產(chǎn)品規(guī)格：20T|50T|100T

貨號：FS-X9734

產(chǎn)品介紹:

本試劑盒適用于檢測哺乳動物組織、細胞Caspase-8活性。Caspase-8也稱FLICE、MACH 或Mch5，通常以酶原的形式存在，凋亡時被激活，被認為是細胞凋亡轉(zhuǎn)導過程的上游caspase。在Fas-receptor和TNFR-1介導的凋亡過程中Caspase-8被激活形成二聚體，進而激活下游Caspase-4,6,9,10。測定原理基于Caspase-8特異水解多肽底物IETD-pNA(Ile-Glu-Thr-Asp-p-nitroanilide)，釋放的游離硝基pNA在405nm有大吸光度。采用可見光光度比色法測定pNA而得到Caspase活性。

儲存條件：按標簽標示分別保存試劑，有效期1年

實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大??；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；

2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；

5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

opiorphin(opiorphin)英文名：opiorphin BTBD6蛋白抗體包裝5g

N-乙?；?絲酰-天門冬酰-賴酰-脯(AcSDKP)英文名：AcSDKP BMP內(nèi)皮調(diào)節(jié)蛋白抗體包裝25g

N-乙酰-β-D-基葡萄糖苷(NAG)英文名：NAG 肝病NS5A反轉(zhuǎn)錄蛋白8抗體包裝5g

N端前腦鈉(NT-proBNP)英文名：NT-proBNP 骨形態(tài)發(fā)生蛋白1/膠原C蛋白肽鏈內(nèi)切抗體包裝1g

NANOG同源域蛋白(NANOG)英文名：NANOG 骨形態(tài)發(fā)生蛋白9抗體包裝5g

NAD依賴性蛋白脫乙酰sirtuin-1(SIRT1)英文名：SIRT1 微管蛋白β輔助因子D抗體包裝25g

NADPH氧化1(NOX1)英文名：NOX1 鈣粘蛋白相關(guān)蛋白受體BTR1抗體包裝5g

M型肌激(CKM)英文名：CKM 有絲分裂蛋白BUB3抗體包裝1g

MAP激活化蛋白激2(MAPKAPK2)英文名：MAPKAPK2 p60TRP蛋白抗體包裝5g

L選擇(L-Selectin/CD62L)英文名：L-Selectin/CD62L 博萊霉解抗體包裝1g

L-乳脫氫A鏈(LDH-A)英文名：LDH-A 短蛋白聚糖抗體包裝5g

L解(PAL)英文名：PAL BTB/POZ結(jié)構(gòu)域蛋白3抗體包裝10MG

Klotho(Klotho)英文名：Klotho 巴爾得-別德爾綜合征相關(guān)蛋白12抗體包裝100g

KI-67抗原(MKI67)英文名：MKI67 堿性亮拉鏈蛋白BZW1抗體包裝25g

I型膠原蛋白(COL-1)英文名：COL-1 骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體1B抗體包裝5g

ASH1蛋白抗體肝核因子1β(HNF1β)CWHM-12是αV整聯(lián)蛋白的有效抑制劑，抑制αvβ8，αvβ3，αvβ6和αvβ1的 IC50 值分別為0.2，0.8，1.5，1.8 nM。
Caspase-8活性測定試劑盒青霉 2-乙可溶性血管生成受體激2

金針菇（毛柄、冬菇） 5-氨基鄰甲酚硫酸鹽可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白

大腸埃希 4-氨基-3-吡啶可溶性血纖蛋白單體復合物

牛瘟病二(2-甲基-2-烯酸)2-羥基-1,3-酯可溶性腫瘤壞死因子受體1

芽孢桿 5-氟-2-甲氧基苯可溶性腫瘤壞死因子受體1

異常漢遜酵母 4-溴-2,6-二氟可溶性腫瘤壞死因子受體2

蘇云金芽孢桿錫盧亞種 N-(叔丁氧基羰基)-對甲苯磺?？扇苄阅[瘤壞死因子受體2

甲基桿屬 N-甲基-2-氟苯可溶性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體

根瘤氫氧化鉛可溶性腫瘤壞死因子樣凋亡微弱誘導劑

寄生曲霉 (R)-(+)-二氨基烷可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體

偽假蒼黃異辛酸鈉可替丁

多主葡萄殼 4-芐克拉拉蛋白

無二酸檸檬酸桿 4-基-1-羧酸乙酯空腸彎曲黏附蛋白

木賊鐮孢 2-氟-5-空泡相關(guān)蛋白A

香菇 2-氟-4-羥基苯鹽酸鹽狂犬病抗原
操作規(guī)程

1、在96孔板加入細胞100μL/孔，通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細胞（具體每孔所用的細胞的數(shù)目，需根據(jù)細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育適當時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞），各重復孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細胞的OD 值，C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)