Caspase-3活性測定試劑盒-上海撫生實業(yè)有限公司

貨號	FS-X9738

產(chǎn)品介紹:

本試劑盒適用于測定哺乳動物組織、細(xì)胞caspase-3活性。測定原理基于Caspase-3特異水解多肽底物acetyl-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilide(Ac-DEVD-pNA)，釋放硝基pNA。游離硝基pNA呈黃色在405nm具有大吸收峰，用普通可見光分光光度比色方法測定。根據(jù)pNA標(biāo)準(zhǔn)管吸光度OD值和標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算來自底物肽釋放的pNA濃度，得到Caspase-3水解活性。

Caspase-3是凋亡過程中主要的終末剪切酶，因而也是研究多的caspase，它激活pro-caspase-2,6,7,9等，特異水解多種凋亡關(guān)鍵蛋白如PARP，介導(dǎo)細(xì)胞核染色質(zhì)固縮、凋亡小體生成、核DNA斷裂。

運輸及保存：試劑常溫運輸。到達(dá)后按要求儲存，1年內(nèi)穩(wěn)定。

所需儀器：酶標(biāo)儀與96孔酶標(biāo)板；或可見光分光光度計配100μl容積的石英比色杯。

工作波長：大吸收波長405nm，如不具備也可在400～450nm范圍內(nèi)測定，但靈敏度略降。

中文名稱：Caspase-3活性測定試劑盒

英文名稱：Caspase-3 Activity colorimetric assay Kit

產(chǎn)品規(guī)格：20T|50T|100T

貨號：FS-X9738

實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大??；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細(xì)胞，細(xì)胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時；

4．將經(jīng)過計數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測。

Ⅲ型前膠原肽(PⅢNP)英文名：PⅢNP β分泌抗體包裝5g

Ⅲ型前膠原基端肽(PⅢNT)英文名：PⅢNT 相關(guān)死亡促進因子Bad抗體包裝100ml

Ⅲ型前膠原(HPCⅢ)英文名：HPCⅢ Bax包裝25ml

Ⅲ型膠原(Col Ⅲ)英文名：Col Ⅲ 程序性死亡配體2抗體包裝500ml

Ⅱ型膠原螺旋肽(HELIX-Ⅱ)英文名：HELIX-Ⅱ 膽汁鹽輸出泵/ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白11抗體包裝1g

Ⅱ型膠原C端肽(CTX-Ⅱ)英文名：CTX-Ⅱ β2微球蛋白抗體(單抗)包裝1g

Ⅱ型膠原(ColⅡ)英文名：ColⅡ 骨/軟骨蛋白多糖1抗體包裝5g

Ⅱ型膠原(Col Ⅱ)英文名：Col Ⅱ 染色體相關(guān)蛋白CAP抗體包裝1g

Ⅰ型前膠原羧基端肽(PⅠCP)英文名：PⅠCP Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域樣蛋白1抗體包裝250mg

Ⅰ型前膠原N端前肽(PⅠNP)英文名：PⅠNP Bcl2相關(guān)抗凋亡基因6抗體包裝10g

Ⅰ型前膠原C末端肽(CⅠCP)英文名：CⅠCP 半乳糖轉(zhuǎn)移7亞基β1,4抗體包裝50g

Ⅰ型膠原交聯(lián)羧基末端肽(ⅠCTP)英文名：ⅠCTP BEN結(jié)構(gòu)域蛋白5抗體包裝100g

Ⅰ型膠原N末端肽(NTX)英文名：NTX 巴德-畢德氏綜合征蛋白BBS5抗體包裝25g

Ⅰ型膠原C端肽(CTX-Ⅰ)英文名：CTX-Ⅰ 癌相關(guān)蛋白1抗體包裝500g

Ⅰ型膠原(ColⅠ)英文名：ColⅠ 腦蛋白CG6抗體包裝1g

膽汁結(jié)合蛋白DDH2抗體促狀腺胚胎因子(TEF)PX-478 是有抗癌活性的缺氧誘導(dǎo)因子-1α (HIF-1α) 抑制劑，對一些癌系 IC50 為 20-30 μM。
Caspase-3活性測定試劑盒禾谷絲核 3--6-肼基噠磷脂A2

伊平屋橋大洋芽孢桿 2-甲基四氫噻吩磷脂A2受體

白僵 3,4-二乙酸磷脂A2受體1

交鏈孢霉 3-乙基噻吩磷脂酰

腦膜炎奈瑟 3-溴-2-羥基-5-磷脂酰甘油

金龜子綠僵 4-N-Boc-氨基環(huán)己酮磷脂酰肌蛋白聚糖1

棒桿化鐠(III)六水合物磷脂酰肌蛋白聚糖3

釀酒酵母 2-氟-4-溴甲酯磷脂酰肌抗體IgG;IgM

腐生葡萄球腐生亞種化鑭(III)六水合物磷脂酰

釀酒酵母 5-(甲氧羰基)-2-吡啶羧酸磷脂轉(zhuǎn)移蛋白

喜肌費爾酵母甲基(-3-基)氨酸叔丁酯磷酯Cγ鏈

橄欖鏈霉對肼基苯磺酰鹽酸鹽磷酯酰肌蛋白聚糖3

青紫黑鏈霉 2-乙氧基乙酸乙酯鱗狀癌相關(guān)抗原

豬鏈球分型血清參考品血清型 SS34 甲基天冬氨酸流感病IgG抗體

乳微桿 4-羥丁基乙烯基流行性腮腺炎

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