Annexin V-PE/7-AAD凋亡流式檢測(cè)試劑盒-上海撫生實(shí)業(yè)有限公司

貨號(hào)	FS-X9558

中文名稱：Annexin V-PE/7-AAD凋亡流式檢測(cè)試劑盒

英文名稱：Annexin V-PE/7-AAD Apoptosis Detection Kit

產(chǎn)品規(guī)格：50次

貨號(hào)：FS-X9558

產(chǎn)品介紹:

本試劑盒是一種采用Annexin-PE與7-AAD雙染法進(jìn)行細(xì)胞早期凋亡分析的檢測(cè)試劑盒。

細(xì)胞凋亡早期改變發(fā)生在細(xì)胞膜表面，這些細(xì)胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨(PS)從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外，使PS暴露在細(xì)胞膜外表面。PS是一種帶負(fù)電荷的磷脂，正常主要存在于細(xì)胞膜的內(nèi)面，在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)細(xì)胞膜上的這種磷脂分布的不對(duì)稱性被破壞而使PS暴露在細(xì)胞膜外。Annexin V具有易于結(jié)合到磷脂類如PS的特性，對(duì)PS有高度的親和性。因此，該蛋白可充當(dāng)一敏感的探針檢測(cè)暴露在細(xì)胞膜表面的PS。PS轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外不是凋亡所*的，也可發(fā)生在細(xì)胞壞死中。兩種細(xì)胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細(xì)胞膜是完好的，而細(xì)胞壞死在其早期階段細(xì)胞膜的完整性就被破壞。7-AAD是一種核酸染料，可進(jìn)入死細(xì)胞內(nèi)與DNA結(jié)合，能夠?qū)乃篮偷蛲鐾砥诘募?xì)胞進(jìn)行染色。7-ADD與PI有著相似的熒光特性，但其發(fā)射波譜較PI窄，對(duì)其他檢測(cè)通道的干擾更小，在多色熒光分析中是PI的佳替代品，因此通常將Annexin V-PE與ADD配合染色，以區(qū)別凋亡早期細(xì)胞與壞死細(xì)胞和凋亡的晚期細(xì)胞。

操作步驟：

1、細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：

a．對(duì)于貼壁細(xì)胞：小心收集細(xì)胞培養(yǎng)液到一離心管內(nèi)備用。用酶消化細(xì)胞，至細(xì)胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時(shí)，加入前面收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打下所有的貼壁細(xì)胞，并輕輕吹散細(xì)胞。再次收集到離心管內(nèi)。1000×g左右離心3-5分鐘，沉淀細(xì)胞。對(duì)于特定的細(xì)胞，如果細(xì)胞沉淀不充分，可以適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約50μl左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細(xì)胞。加入約1ml 4℃預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清。再次加入1ml 4℃預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞。

b．對(duì)于懸浮細(xì)胞：1000×g左右離心3-5分鐘，沉淀細(xì)胞。對(duì)于特定的細(xì)胞，如果細(xì)胞沉淀不充分，可以適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約50微升左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細(xì)胞。加入約1ml 4℃預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到1.5毫升離心管內(nèi)。再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清，可以殘留約50μl左右的PBS，以避免吸走細(xì)胞。再次加入1ml 4℃預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞。

2、用去離子水按1:3稀釋Binding Buffer(4ml Binding Buffer+12ml去離子水)。

3、用250μl Binding Buffer重新懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為1×106/ml。

4、取 100μl 的細(xì)胞懸液于 5ml 流式管中，加入 5μl Annexin V-PE 和 10μl 7-AAD 溶液。

5、混勻后于室溫避光孵育 15 分鐘。

6、在反應(yīng)管中加400μl PBS，流式細(xì)胞儀(FACS)分析。

Jurkat細(xì)胞用鉑誘導(dǎo)凋亡后用Annexin V-PE/7AAD雙染流式分析圖譜

儲(chǔ)存條件：2～8℃，避光保存

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個(gè)平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時(shí)；

4．將經(jīng)過計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時(shí)，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大?。?/span>

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測(cè)試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對(duì)照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)

細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子2(SOCS2)檢測(cè)試劑盒 forSuppressorsOfCytokineSignaling2(SOCS2)

jia狀腺結(jié)合球蛋白(TBG)檢測(cè)試劑盒 forThyroxineBindingGlobulin(TBG)

骨成型蛋白7(BMP7)檢測(cè)試劑盒 forBoneMorphogeneticProtein7(BMP7)

解整合su金屬蛋白mei12(ADAM12)檢測(cè)試劑盒 forADisintegrinAndMetalloprotease12(ADAM12)

磷suan泛酰半胱氨suan合成mei(PPCS)檢測(cè)試劑盒 forPhosphopantothenoylcysteineSynthetase(PPCS)

肌動(dòng)絲蛋白(AF)檢測(cè)試劑盒 forActinfilin(AF)

蛋白激meiCβ1(PKCβ1)檢測(cè)試劑盒 forProteinKinaseCBeta1(PKCb1)

蛋白C(PROC)檢測(cè)試劑盒 forProteinC(PROC)

Smad同源物3(Smad3)檢測(cè)試劑盒 forMothersAgainstDecapentaplegicHomolog3(Smad3)

L1-細(xì)胞粘附分子(L1CAM)檢測(cè)試劑盒 forL1-CellAdhesionMolecule(L1CAM)

Toll樣受體7(TLR7)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：TLR7 ELISA Kit，TLR7，

ICOS配體(ICOSLG)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：ICOSLG ELISA Kit，ICOSLG，

P選擇su(P-Selectin/CD62P/GMP140)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：P-Selectin/CD62P/GMP140 ELISA Kit，P-Selectin/CD62P/GMP140，

CXC趨化因子受體3(CXCR3)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：CXCR3 ELISA Kit，CXCR3，

C4結(jié)合蛋白(C4BP)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：C4BP ELISA Kit，C4BP，

Ⅲ型前膠原C端肽(PⅢCP)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：PⅢCP ELISA Kit，PⅢCP，

4-羥基壬烯suan(HNE)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：HNE ELISA Kit，HNE，
Annexin V-PE/7-AAD凋亡流式檢測(cè)試劑盒納他霉su標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Natamycin

相關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:100mg 英文名稱：Terfenadine Related Compound A

fu化鈉標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:1g 英文名稱：

非索非那定相關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:25mg 英文名稱：

龍醋suan特丁酯標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Prednisolone Tebutate

化鉀標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:1g 英文名稱：Potassium Iodide (AS)

碘海chun相關(guān)化合物B標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:50mg 英文名稱：

碘fuchun相關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:50mg 英文名稱：

戊硫代巴比標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:250mg 英文名稱：Thiopental CIII

戊巴比標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Pentobarbital CII

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