細(xì)胞增殖示蹤熒光探針-上海撫生實(shí)業(yè)有限公司

貨號(hào)	FS-X9641

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無(wú)菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個(gè)平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時(shí)；

4．將經(jīng)過(guò)計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時(shí)，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。

中文名稱：細(xì)胞增殖示蹤熒光探針

英文名稱：CFDA, SE

產(chǎn)品規(guī)格：25mg

貨號(hào)：FS-X9641

產(chǎn)品介紹:

CFDA, SE，英文全稱Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester，是一種可對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記的細(xì)胞示蹤染料，不僅可用于細(xì)胞增殖的體外實(shí)驗(yàn)，還可用于追蹤細(xì)胞在體內(nèi)的分裂增殖過(guò)程。

CFDA, SE是二乙酸熒光素（Fluorescein diacetate，F(xiàn)DA）的衍生物，具細(xì)胞膜滲透性，本身不具有熒光發(fā)光性。當(dāng)通過(guò)被動(dòng)運(yùn)輸穿透細(xì)胞膜進(jìn)入活細(xì)胞后，可被胞漿內(nèi)的酯酶催化生成羧基熒光素琥珀酰亞胺酯（carboxyfluorescein succinimidyl ester，CFSE），可發(fā)強(qiáng)烈的綠色熒光，不能穿透細(xì)胞膜，能完好的保留在胞內(nèi)。CFSE還可自發(fā)性并不可逆地與細(xì)胞內(nèi)的氨基結(jié)合從而偶聯(lián)到細(xì)胞蛋白質(zhì)上，同時(shí)過(guò)量且未被偶聯(lián)的CFDA, SE通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散回到細(xì)胞外培養(yǎng)基內(nèi)，被后續(xù)清洗步驟所清除。經(jīng)CFDA, SE標(biāo)記的非分裂細(xì)胞的熒光非常穩(wěn)定，穩(wěn)定標(biāo)記的時(shí)間可達(dá)數(shù)月，因此非常適用于細(xì)胞群落分析。

CFDA, SE標(biāo)記細(xì)胞的熒光非常均一，優(yōu)于以前使用的其他細(xì)胞示蹤熒光探針如PKH26，并且分裂后的子代細(xì)胞的熒光分配也更均一。在細(xì)胞分裂增殖過(guò)程中，CFSE 標(biāo)記熒光可平均分配至兩個(gè)子代細(xì)胞中，熒光強(qiáng)度變?yōu)橛H代細(xì)胞的一半，通過(guò)流式細(xì)胞儀（FL1通道）根據(jù)熒光強(qiáng)度的不同，可檢測(cè)出未分裂細(xì)胞，分裂一次（1/2的熒光強(qiáng)度），二次（1/4的熒光強(qiáng)度），三次（1/8的熒光強(qiáng)度），以及更多分裂次數(shù)的細(xì)胞。CFSA，SE可檢測(cè)分裂次數(shù)多達(dá)八次甚至更多。經(jīng)CFDA, SE標(biāo)記的細(xì)胞可用于體外和體內(nèi)增殖研究，且具有不會(huì)使鄰近細(xì)胞染色的功能。CFDA, SE常用于淋巴細(xì)胞的增殖檢測(cè)，也可用于成纖維細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞，造血祖細(xì)胞等其他細(xì)胞的增殖檢測(cè)。

CFDA, SE標(biāo)記細(xì)胞呈綠色熒光，Ex=494nm，Em=521nm，除了流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞增殖外，還可用熒光酶標(biāo)板定量活細(xì)胞數(shù)目，或者用熒光顯微鏡進(jìn)行均一染色的細(xì)胞示蹤觀察。本品以粉末形式提供，需用DMSO制備儲(chǔ)存液后再使用。

實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無(wú)菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大小；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過(guò)夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

環(huán)胍氨suan肽(CCP)檢測(cè)試劑盒 forCyclicalCitrullinatedPeptide(CCP)

凋亡相關(guān)因子(FAS)檢測(cè)試劑盒 forFactorRelatedApoptosis(FAS)

腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)檢測(cè)試劑盒 forBrainDerivedNeurotrophicFactor(BDNF)

胎兒血紅蛋白(HBF)檢測(cè)試劑盒 forFetalHemoglobin(HBF)

白介su7受體(IL7R)檢測(cè)試劑盒 forInterleukin7Receptor(IL7R)

Toll樣受體6(TLR6)檢測(cè)試劑盒 forTollLikeReceptor6(TLR6)

絲氨suan/蘇氨suan激mei24(STK24)檢測(cè)試劑盒 forSerine/ThreonineKinase24(STK24)

分泌性白細(xì)胞蛋白mei抑制因子(SLPI)檢測(cè)試劑盒 forSecretoryLeukocytePeptidaseInhibitor(SLPI)

表皮生長(zhǎng)因子途徑底物蛋白3(EPN3)檢測(cè)試劑盒 forEpsin3(EPN3)

血管生成su1(ANGPT1)檢測(cè)試劑盒 forAngiopoietin1(ANGPT1)

泛chun細(xì)胞色suC還原mei核心蛋白Ⅰ(UQCRC1)檢測(cè)試劑盒 forUbiquinolCytochromeCReductaseCoreProteinI(UQCRC1)

細(xì)胞程序性死亡蛋白5(PDCD5)檢測(cè)試劑盒 forProgrammedCellDeathProtein5(PDCD5)

二肽基肽mei9(DPP9)檢測(cè)試劑盒 forDipeptidylPeptidase9(DPP9)

癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞粘附分子7(CEACAM7)檢測(cè)試劑盒 forCarcinoembryonicAntigenRelatedCellAdhesionMolecule7(CEACAM7)

白介su28A(IL28A)檢測(cè)試劑盒 forInterleukin28A(IL28A)

尿二磷suan糖基轉(zhuǎn)移mei8(UGT8)檢測(cè)試劑盒 forUDPGlycosyltransferase8(UGT8)

jia狀旁腺su受體2(PTHR2)檢測(cè)試劑盒 forParathyroidHormoneReceptor2(PTHR2)
細(xì)胞增殖示蹤熒光探針沙平相關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:20mg 英文名稱：Loxapine Related Compound A

鈣標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:100mg 英文名稱：Atorvastatin Calcium

鹽suan醋丁爾標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:125mg 英文名稱：Acebutolol Hydrochloride

帕拉金糖標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:5g 英文名稱：Isomaltulose

鹽suan普羅帕tong標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Propafenone Hydrochloride

膦jiasuan鈉標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:50mg 英文名稱：Foscarnet Sodium

匹伐lv可托龍標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Clocortolone Pivalate

拉西坦外消旋混合物標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:15mg 英文名稱：Levetiracetam Racemic Mixture

乙suan異fu潑尼龍標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Isoflupredone Acetate

尿suan二鈉標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:500mg 英文名稱：Disodium 5-Uridylate
操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度（如無(wú)570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測(cè)試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無(wú)細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無(wú)細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對(duì)照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)