細胞凋亡檢測試劑盒I(POD)-上海撫生實業(yè)有限公司

貨號	FS-X9643

產(chǎn)品介紹:

工作原理：

在機體內(nèi)部隨時都在發(fā)生著細胞的死亡。傳統(tǒng)上用顯微鏡來觀察細胞的死亡，其特征為核染色質(zhì)的濃縮及碎片的形成。但是這種現(xiàn)象出現(xiàn)的很晚，時間也很短暫。凋亡的特征是內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，細胞自身的染色質(zhì)或DNA被切割，出現(xiàn)單鏈或雙鏈缺口，并產(chǎn)生與 DNA 斷點數(shù)目相同的3’-OH末端。末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal deoxynucleotidyl Transferase)可以將標(biāo)記的dUTP(DIG-dUTP)標(biāo)記至 3’-OH末端，DIG-dUTP結(jié)合在DNA斷點部位，可以通過生物標(biāo)記的抗抗體(Anti-DIG-Biotin)反應(yīng)后，再結(jié)合鏈酶親和素-過氧化物酶(SABC)，然后加入顯色底物DAB予以顯示。凋亡的細包核呈黃色，從而可以在顯微鏡下觀察到著色的凋亡細胞。

試劑盒內(nèi)容：

1．標(biāo)記緩沖液(Labeling Buffer)1ml

2．末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(TdT,×20)20μl

3．DIG-dUTP(×20)20μl

4．封閉液(Blocking Reagent)4ml

5．生物su化抗抗體(× 100)20μl

6．SABC(× 100)20μl

7．Proteinase K(×200)50μl

8．抗體稀釋液 4ml

保存條件：-20℃冰凍保存。

保存期：一年

中文名稱：細胞凋亡檢測試劑盒I(POD)

英文名稱：

產(chǎn)品規(guī)格：20T

貨號：FS-X9643

實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大??；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；

2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；

5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細胞100μL/孔，通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細胞（具體每孔所用的細胞的數(shù)目，需根據(jù)細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細胞的OD 值，C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時；

4．將經(jīng)過計數(shù)的細胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進行快速固定以及免疫細胞化學(xué)檢測。

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細胞凋亡檢測試劑盒I(POD)氨jia環(huán)suan相關(guān)物質(zhì)C標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:15mg 英文名稱：

紫杉chun標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Paclitaxel

富馬suan噻吡二an標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Methapyrilene Fumarate

妥布霉su標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:350mg 英文名稱：Tobramycin

睡茄交酯 A標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:15mg 英文名稱：Withanolide A

利相關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:15mg 英文名稱：

綠原suan標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:50mg 英文名稱：Chlorogenic Acid

鹽suan拉貝爾標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Labetalol Hydrochloride

異fu烷相關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:0．1ml 英文名稱：

ben磺suan美索達嗪標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:250mg 英文名稱：Mesoridazine Besylate