Annexin V-PE/7-AAD雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒-上海撫生實(shí)業(yè)有限公司

貨號(hào)	FS-X9562

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個(gè)平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時(shí)；

4．將經(jīng)過計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時(shí)，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測。

中文名稱：Annexin V-PE/7-AAD雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒

英文名稱：Annexin V-PE/7-AAD Apoptosis Detection Kit

產(chǎn)品規(guī)格：10T|20T|50T|100T

貨號(hào)：FS-X9562

產(chǎn)品介紹:

在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨suan（PS）只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨suan（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V 是一種分子量為35~36kD 的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨suan有高度親和力，故可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨suan與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin V 被作為檢測細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。將Annexin V 進(jìn)行熒光素PE 標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin V 作為熒光探針，利用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

7-AAD（7-amino-actinomycin D）是一種核酸染料，它不能通過正常質(zhì)膜，隨著細(xì)胞凋亡、細(xì)胞死亡過程，質(zhì)膜對(duì)7-AAD 的通透性逐漸增加，結(jié)合細(xì)胞凋亡中DNA 的有控降解，在合適波長激發(fā)光的激發(fā)下可發(fā)出明亮的紅色熒光，通過7-AAD 標(biāo)記DNA 的強(qiáng)弱，將細(xì)胞分為三群：7-AAD 強(qiáng)為死亡細(xì)胞，7-AAD 弱是凋亡細(xì)胞，7-AAD-為正?；盍?xì)胞。7-AAD 同PI 有著相似的熒光特性，但其發(fā)射波譜較PI 窄，對(duì)其他檢測通道的干擾更小，在多色熒光分析中是PI 的佳替代品，可與Annexin V-PE 聯(lián)合使用。

本試劑盒可應(yīng)用于培養(yǎng)細(xì)胞凋亡檢測（不推薦用于檢測組織樣本）。

實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大??；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

Nexn結(jié)合蛋白(NEXN)elisa檢測試劑盒英文名稱：NEXN ELISA Kit，NEXN，

Metaxin1蛋白(MTX1)elisa檢測試劑盒英文名稱：MTX1 ELISA Kit，MTX1，

Kaptin蛋白(KPTN)elisa檢測試劑盒英文名稱：KPTN ELISA Kit，KPTN，

G蛋白偶聯(lián)雌激su受體1(GPER)elisa檢測試劑盒英文名稱：GPER ELISA Kit，GPER，

Epigen蛋白(EPG)elisa檢測試劑盒英文名稱：EPG ELISA Kit，EPG，

C-型凝集su域家族11成員A(CLEC11A)elisa檢測試劑盒英文名稱：CLEC11A ELISA Kit，CLEC11A，

Clarin1蛋白(CLRN1)elisa檢測試劑盒英文名稱：CLRN1 ELISA Kit，CLRN1，

B-細(xì)胞激活因子(BAFF)elisa檢測試劑盒英文名稱：BAFF ELISA Kit，BAFF，

蛋白激meiCζ(PKCζ)elisa檢測試劑盒英文名稱：PKCζ ELISA Kit，PKCζ，

穿孔su1(PRF1)elisa檢測試劑盒英文名稱：PRF1 ELISA Kit，PRF1，

單酰甘油-O-?；D(zhuǎn)移mei3(MOGAT3)elisa檢測試劑盒英文名稱：MOGAT3 ELISA Kit，MOGAT3，

層粘連蛋白β2(LAMβ2)elisa檢測試劑盒英文名稱：LAMβ2 ELISA Kit，LAMβ2，

博來霉su水解mei(BLMH)elisa檢測試劑盒英文名稱：BLMH ELISA Kit，BLMH，

胞裂蛋白14(SEPT14)elisa檢測試劑盒英文名稱：SEPT14 ELISA Kit，SEPT14，

半胱氨suan豐富分泌蛋白3(CRISP3)elisa檢測試劑盒英文名稱：CRISP3 ELISA Kit，CRISP3，

白介su31(IL31)elisa檢測試劑盒英文名稱：IL31 ELISA Kit，IL31，

白介su17(IL17)elisa檢測試劑盒英文名稱：IL17 ELISA Kit，IL17，
Annexin V-PE/7-AAD雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒相關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:25mg 英文名稱：

扎西他濱標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Zalcitabine

扎西他濱相關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:50mg 英文名稱：Zalcitabine Related Compound A

L-精氨suan標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：L-Arginine

標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:25mg 英文名稱：Alprostadil

丙an卡因相關(guān)物質(zhì)B標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:50mg 英文名稱：Prilocaine Related Compound B

標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:1g 英文名稱：Potassium Chloride (AS)

亞an培南一水合物標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:100mg 英文名稱：Imipenem Monohydrate

醋suan亮丙瑞林標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：

依替膦suan鈉標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Etidronate Disodium
操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對(duì)照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)