Caspase 3分光光度法檢測試劑盒-上海撫生實業(yè)有限公司

貨號	FS-X9570

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時；

4．將經(jīng)過計數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測。

中文名稱：Caspase 3分光光度法檢測試劑盒

英文名稱：Caspase-3 Colorimetric Assay Kit

產(chǎn)品規(guī)格：20T|50T|100T

貨號：FS-X9570

產(chǎn)品介紹:

本試劑盒適用于培養(yǎng)細(xì)胞及新鮮組織caspase-3 檢測。Caspase 家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3 為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，與DNA 斷裂、染色質(zhì)凝聚和凋亡小體形成有關(guān)。Caspase-3 在正常狀態(tài)下以酶原的形式存在于胞漿中，沒有活性；但在細(xì)胞發(fā)生凋亡階段，它被激活，活化的Caspase-3 由兩個大亞基和兩個小亞基組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Caspase-3 分光光度法檢測試劑盒就是將caspase-3 序列特異性的多肽偶聯(lián)至發(fā)色基團(tuán)。當(dāng)該底物被Caspase-3 剪切后，發(fā)色基團(tuán)即游離出來，可通過酶標(biāo)儀或分光光度計（λ=405nm或400nm）測定其吸光值，考察caspase-3 的活化程度。

注意事項

1. Caspase-3 Substrate 避光保存及使用。

2. 對某些凋亡誘導(dǎo)劑引起的細(xì)胞凋亡可能存在非依賴于Caspase-3 活化的機(jī)制，這種情況時利用本試劑盒檢測Caspase-3 活性無明顯改變，需要考慮凋亡機(jī)制中的其他信號通路。

3. 細(xì)胞數(shù)量需達(dá)到3~5×106 個或新鮮組織50~100mg，以便能達(dá)到測定需要的100~200μg 蛋白的要求，因為Caspase-3 的活性與細(xì)胞裂解液的蛋白含量有關(guān)，如測定的OD 值偏低，可通過增加細(xì)胞數(shù)量或組織量的方法來提高蛋白量。

實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大??；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

表面活性物質(zhì)關(guān)聯(lián)蛋白D(SPD)檢測試劑盒 forSurfactantAssociatedProteinD(SPD)

細(xì)胞間粘附分子2(ICAM2)檢測試劑盒 forIntercellularAdhesionMolecule2(ICAM2)

蛋白信號調(diào)節(jié)因子6(RGS6)檢測試劑盒 forRegulatorOfGProteinSignaling6(RGS6)

α2-纖溶mei抑制因子(α2PI)檢測試劑盒 forAlpha-2-PlasminInhibitor(a2PI)

25-羥基維生suD3(HVD3)檢測試劑盒 for25-HydroxyvitaminD3(HVD3)

信號su3A(SEMA3A)檢測試劑盒 forSemaphorin3A(SEMA3A)

亞jia基四氫葉suan脫氫mei2(MTHFD2)檢測試劑盒 forMethylenetetrahydrofolateDehydrogenase2(MTHFD2)

葡萄糖木糖基轉(zhuǎn)移mei1(GXYLT1)檢測試劑盒 forGlucosideXylosyltransferase1(GXYLT1)

α1-抗胰糜蛋白mei(α1ACT)檢測試劑盒 forAlpha-1-Antichymotrypsin(a1ACT)

jia狀旁腺激su(PTH)檢測試劑盒 forParathyroidHormone(PTH)

胰島su樣生長因子結(jié)合蛋白7(IGFBP7)檢測試劑盒 forInsulinLikeGrowthFactorBindingProtein7(IGFBP7)

CD200受體1(CD200R1)檢測試劑盒 forCD200Receptor1(CD200R1)

纖維蛋白原β(FGβ)檢測試劑盒 forFibrinogenBeta(FGb)

異染色質(zhì)蛋白1(HP1)檢測試劑盒 forHeterochromatinProtein1(HP1)

肌原纖蛋白1(FBN1)檢測試劑盒 forFibrillin1(FBN1)

腫瘤壞死因子α(TNFα)檢測試劑盒 forTumorNecrosisFactorAlpha(TNFa)

腱蛋白樣蛋白1(CHRDL1)檢測試劑盒 forChordinLikeProtein1(CHRDL1)
Caspase 3分光光度法檢測試劑盒去氧孕烯相關(guān)物質(zhì)B標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:15mg 英文名稱：

匹an標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:300mg 英文名稱：Cefpiramide

對jiaben磺酰an標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：p-Toluenesulfonamide

葡萄糖suan奎尼丁標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Quinidine Gluconate

鹽suanmi托蒽醌標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:400mg 英文名稱：Mitoxantrone Hydrochloride

無水天冬酰an標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Asparagine Anhydrous

fu諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Norfloxacin

阿伏ben宗標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:500mg 英文名稱：Avobenzone

克標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:400mg 英文名稱：Cefaclor

六lv酚標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:500mg 英文名稱：Hexachlorophene
操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細(xì)胞，細(xì)胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)