Caspase 8分光光度法檢測試劑盒-上海撫生實業(yè)有限公司

貨號	FS-X9574

英文名稱：Caspase-8 Colorimetric Assay Kit

產品規(guī)格：20T|50T|100T

貨號：FS-X9574

產品介紹:

本試劑盒適用于培養(yǎng)細胞及新鮮組織caspase-8 檢測。Caspase 家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用。在CD95 凋亡途徑中， Caspase-8 作為上游的級聯(lián)酶，可被TNF 激活。受細胞表面受體（如Fas）的激活，Caspase-8 能引起下游級聯(lián)酶的活性，如Caspase-3。Caspase-8 在正常狀態(tài)下以酶原的形式存在于胞漿中，沒有活性；但在細胞發(fā)生凋亡階段，它可被激活。Caspase-8 分光光度法檢測試劑盒就是將caspase-8 序列特異性的多肽偶聯(lián)至發(fā)色基團，當該底物被caspase-8 剪切后，發(fā)色基團即游離出來，可通過酶標儀或分光光度計（λ=405nm 或400nm）測定其吸光值，可考察caspase-8 的活化程度。

注意事項

1. 對某些凋亡誘導劑引起的細胞凋亡可能存在非依賴于Caspase-8 活化的機制，這種情況時利用本試劑盒檢測Caspase-8 活性無明顯改變，需要考慮凋亡機制中的其他信號通路。

2. Caspase-8 Substrate 避光保存及使用。

3. 細胞數量需達到3~5×106 個或新鮮組織100mg，以便能達到測定需要的100~200μg 蛋白的要求，因為Caspase-8 的活性與細胞裂解液的蛋白含量有關，如測定的OD 值偏低，可通過增加細胞數量或組織量的方法來提高蛋白量。

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內20-30 厘米處照射2-3小時；

4．將經過計數的細胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當貼壁細胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進行快速固定以及免疫細胞化學檢測。

實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大小；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；

2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；

5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細胞100μL/孔，通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細胞（具體每孔所用的細胞的數目，需根據細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育適當時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結果分析

a、細胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞），各重復孔的OD 值取平均數±SD。細胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細胞的OD 值，C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)

G蛋白偶聯(lián)雌激su受體1(GPER)檢測試劑盒 forGProteinCoupledEstrogenReceptor1(GPER)

shi蛋白5(OPN5)檢測試劑盒 forOpsin5(OPN5)

脂蛋白a(Lpa)檢測試劑盒 forLipoprotein,a(Lpa)

神經營養(yǎng)因子3(NT3)檢測試劑盒 forNeurotrophin3(NT3)

中腦核仁蛋白(MIDN)檢測試劑盒 forMidnolin(MIDN)

粘蛋白3(MUC3)檢測試劑盒 forMucin3(MUC3)

內皮su1(EDN1)檢測試劑盒 forEndothelin1(EDN1)

補體因子P(CFP)檢測試劑盒 forComplementFactorP(CFP)

胞漿磷蛋白3(STMN3)檢測試劑盒 forStathmin3(STMN3)

封閉蛋白5(CLDN5)檢測試劑盒 forClaudin5(CLDN5)

神經介suS(NMS)檢測試劑盒 forNeuromedinS(NMS)

肌球蛋白輕鏈1(MYL1)檢測試劑盒 forMyosinLightChain1,Alkali,FastSkeletal(MYL1)

D-二聚體(D2D)檢測試劑盒 forD-Dimer(D2D)

小泛su相關修飾蛋白2(SUMO2)檢測試劑盒 forSmallUbiquitinRelatedModifierProtein2(SUMO2)

補體成分3(C3)檢測試劑盒 forComplementComponent3(C3)

過氧化氫mei(CAT)檢測試劑盒 forCatalase(CAT)

肝型脂肪suan結合蛋白(FABP1)檢測試劑盒 forFattyAcidBindingProtein1,Liver(FABP1)
Caspase 8分光光度法檢測試劑盒標準品規(guī)格:200mg 英文名稱：Modafinil CIV

丙二chun二辛suan酯/二癸suan酯標準品規(guī)格:1ml 英文名稱：

噻lv匹定相關物質A標準品規(guī)格:20mg 英文名稱：Ticlopidine Related Compound A

噻lv匹定相關物質B標準品規(guī)格:20mg 英文名稱：Ticlopidine Related Compound B

相關物質C標準品規(guī)格:20mg 英文名稱：Modafinil Related Compound C

大豆粉標準品規(guī)格:2．5g 英文名稱：Defatted Powdered Soy

tong芬相關物質C標準品規(guī)格:20mg 英文名稱：

聚葡萄糖標準品規(guī)格:200mg 英文名稱：Polydextrose

環(huán)絲氨suan標準品規(guī)格:250mg 英文名稱：Cycloserine

zuo肟標準品規(guī)格:350mg 英文名稱：Ceftizoxime

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