MTT細(xì)胞增值與毒性檢測試劑盒-上海撫生實(shí)業(yè)有限公司

貨號	FS-X9676

英文名稱：MTT Cell Proliferation and Cytotoxicity Assay Kit

產(chǎn)品規(guī)格：500T

貨號：FS-X9676

產(chǎn)品介紹:

MTT可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成結(jié)晶狀的深紫色產(chǎn)物formazan，在特定溶劑存在的情況下，可以被*溶解，然后通過酶標(biāo)儀可以測定490nm波長附近的吸光度。細(xì)胞增殖越多越快，則吸光度越高;細(xì)胞毒性越大，則吸光度越低。

使用說明：

1.收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，分于96孔板，每孔180μL，3000-10000個(gè)細(xì)胞/孔。

2.置37℃、5%CO2溫箱培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁，培養(yǎng)6-24小時(shí)。

3.加入適當(dāng)濃度的受試化合物，繼續(xù)培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間。

4.小心吸去上清，加入90μL新鮮培養(yǎng)液，再加入10μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。

5.然后吸掉上清，每孔加入110μL Formazan溶解液，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光值。

6.同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、MTT、 Formazan溶解液)，對照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、 Formazan溶解液)，每組設(shè)定3復(fù)孔。

儲(chǔ)存條件：-20℃

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個(gè)平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時(shí)；

4．將經(jīng)過計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時(shí)，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測。

實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大小；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)

胰島原(PI)英文名：PI 磷化系統(tǒng)性紅斑狼瘡先關(guān)蛋白TREX1抗體包裝1g

胰島樣生長因子結(jié)合蛋白6(IGFBP-6)英文名：IGFBP-6 磷化系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)蛋白TREX1抗體包裝1g

胰島樣生長因子結(jié)合蛋白4(IGFBP-4)英文名：IGFBP-4 接頭相關(guān)蛋白復(fù)合體AP-2μ鏈1抗體包裝25g

胰島樣生長因子結(jié)合蛋白2(IGFBP-2)英文名：IGFBP-2 磷化接頭相關(guān)蛋白復(fù)合體AP-2μ鏈1抗體包裝5g

胰島樣生長因子結(jié)合蛋白1(IGFBP-1)英文名：IGFBP-1 膜粘連蛋白7抗體包裝100g

胰島樣生長因子2(IGF-2)英文名：IGF-2 3號染色體開放閱讀框15抗體包裝500g

胰島樣生長因子1受體(IGF-1R)英文名：IGF-1R 載脂蛋白B受體抗體包裝25g

胰島樣生長因子1(IGF-1)英文名：IGF-1 三磷腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2抗體包裝5g

胰島受體β(ISR-β)英文名：ISR-β 載脂蛋白B抗體包裝1g

胰島降解(IDE)英文名：IDE 花生四烯15脂氧合2抗體包裝25g

胰島(INS)英文名：INS 載脂蛋白C4抗體包裝5g

原激活肽(TAP)英文名：TAP 低密度脂蛋白受體銜接蛋白抗體包裝1g

1(trypsin-1)英文名：trypsin-1 原始廣泛存在蛋白1抗體包裝250mg

(trypsin)英文名：trypsin 錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域蛋白37抗體包裝5g

胰α淀粉(AMY2A)英文名：AMY2A α1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移1包裝25g

激活受體2B抗體程序性死亡蛋白1配體1(PDCD1LG1)Rucaparib phosphate (AG-014699 phosphate) 是一種有效、可口服的 PARP 抑制劑，結(jié)合 PARP1 的Ki 為 1.4
MTT細(xì)胞增值與毒性檢測試劑盒枯草芽胞桿京尼平CD14分子

耐熱拉錢斯氏酵母柚皮CD163分子

長枝木霉酚CD20分子

細(xì)小不動(dòng)桿 2,4-二苯甲CD28分子

凍土毛霉梔子苷CD30分子

枯草芽孢桿 D-(-)-赤蘚糖CD38分子

新城疫病大豆低聚糖CD3分子

醋酸鈣不動(dòng)桿低聚乳CD40分子

高溫放線化汞CD40配體

枯草芽孢桿 4-基-α-D-吡喃鼠李糖苷CD44變體6

短桿屬金雀花堿CD44分子

冬蟲夏草絞股藍(lán)皂苷CD4分子

釀酒酵母黃芪甲苷CD8分子

繡球* 槐果堿CD蛋白(損壞性關(guān)節(jié)炎）

大腸桿 5-甲基-2-氨基-3-硝基吡啶CIP2A

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