細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Annexin V-EGFP/PI)-上海撫生實(shí)業(yè)有限公司

貨號	FS-X9621

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時；

4．將經(jīng)過計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測。

中文名稱：細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Annexin V-EGFP/PI)

英文名稱：Annexin V-EGFP/PI Apoptosis Detection Kit

產(chǎn)品規(guī)格：20 rxn

貨號：FS-X9621

產(chǎn)品介紹:

Annexin V-EGFP/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（Annexin V-EGFP/PI Apoptosis Detection Kit）是用EGFP標(biāo)記了的Annexin V作為探針，來檢測細(xì)胞早期凋亡的發(fā)生，可用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀或其他熒光檢測設(shè)備進(jìn)行檢測。

其檢測原理為：在正常的活細(xì)胞中，磷脂酰絲氨suan（phosphotidylserine，PS）位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在早期凋亡的細(xì)胞中，PS 從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-Ⅴ（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36KD的Ca2+ 依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合?？赏ㄟ^細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨suan與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。

另外，本試劑盒中還提供了碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）用來區(qū)分存活的早期細(xì)胞和壞死或晚期凋亡細(xì)胞。PI是一種核酸染料，它不能透過正常細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞的完整的細(xì)胞膜，但可以透過凋亡晚期和壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此，將Annexin V與PI聯(lián)合使用時，PI 則被排除在活細(xì)胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡細(xì)胞（Annexin V+/PI-）之外，而晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞同時被EGFP 和PI 結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽性（Annexin V+/PI+）。

產(chǎn)品組份：

Annexin V-EGFP———————100 μl

PI Staining Solution————100 μl

1×Binding Buffer——————8 ml

儲存條件：4℃，有效期一年。

實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大?。?/span>

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

再生胰島衍生蛋白3γ(REG3γ)檢測試劑盒 forRegeneratingIsletDerivedProtein3Gamma(REG3g)

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shi黃chun結(jié)合蛋白4(RBP4)檢測試劑盒 forRetinolBindingProtein4,Plasma(RBP4)

凋亡蛋白mei激活因子1(APAF1)檢測試劑盒 forApoptoticPeptidaseActivatingFactor1(APAF1)

肝腎骨性磷suanmei(ALPL)檢測試劑盒 forAlkalinePhosphatase,Liver/Bone/Kidney(ALPL)

精氨suanmei(Arg)檢測試劑盒 forArginase(Arg)

封閉蛋白6(CLDN6)檢測試劑盒 forClaudin6(CLDN6)

糖磺基轉(zhuǎn)移mei3(CHST3)檢測試劑盒 forCarbohydrateSulfotransferase3(CHST3)

白介su11(IL11)檢測試劑盒 forInterleukin11(IL11)

簇集蛋白(CLU)檢測試劑盒 forClusterin(CLU)

suan性葡萄糖meiβ(GβA)檢測試劑盒 forGlucosidaseBeta,Acid(GbA)

成纖維細(xì)胞激活蛋白α(FAPα)檢測試劑盒 forFibroblastActivationProteinAlpha(FAPa)

原肌球調(diào)節(jié)蛋白4(TMOD4)檢測試劑盒 forTropomodulin4(TMOD4)

神經(jīng)介suB(NMB)檢測試劑盒 forNeuromedinB(NMB)
細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Annexin V-EGFP/PI)標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Cimetidine

比哌立登標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Biperiden

醋suanfu氫標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:250mg 英文名稱：Fludrocortisone Acetate

酒石suan腎上腺su標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Epinephrine Bitartrate

fu康zuo相關(guān)物質(zhì)C標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:10mg 英文名稱：

布地na德標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Budesonide

異丙腎上腺su鹽suan鹽標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:125mg 英文名稱：Isoproterenol Hydrochloride

an碘tong相關(guān)物質(zhì)D標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:20mg 英文名稱：Amiodarone Related Compound D

5-fu脲嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:250mg 英文名稱：Fluorouracil

lv磷定標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Pralidoxime Chloride
操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)