支原體檢測(cè)試劑盒-上海撫生實(shí)業(yè)有限公司

貨號(hào)	FS-X9681

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無(wú)菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個(gè)平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時(shí)；

4．將經(jīng)過(guò)計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時(shí)，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。

中文名稱：支原體檢測(cè)試劑盒

英文名稱：Mycoplasma Detection Kit

產(chǎn)品規(guī)格：100T-200T

貨號(hào)：FS-X9681

產(chǎn)品介紹:

本試劑盒是利用熒光染料檢測(cè)支原體污染。這種染料會(huì)結(jié)合到DNA的A-T富集區(qū)域，因?yàn)橹гw的DNA中A-T含量高(55％～80％)，所以可將其染色而被檢測(cè)到。被支原體污染的細(xì)胞經(jīng)染色后在細(xì)胞周圍可看到許多大小均一的熒光小點(diǎn)，即為支原體的DNA染色斑，說(shuō)明有支原體污染。Hoechst 33258的大激發(fā)波長(zhǎng)為346nm，大發(fā)射波長(zhǎng)為460nm;Hoechst 33258和雙鏈DNA結(jié)合后，大激發(fā)波長(zhǎng)為352nm，大發(fā)射波長(zhǎng)為461nm。

操作步驟：

貼壁細(xì)胞：

1.被檢細(xì)胞接種于無(wú)菌的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種密度為1-2×104。同時(shí)，接種正常無(wú)支原體感染的同種細(xì)胞，作為陰性對(duì)照。

2.5天后，先吸去培養(yǎng)液，再加入1ml的固定液，靜置20min，

3.吸去固定液，晾干。

4.于每孔中，加入1ml的Hoechst33258工作液(Hoechst 33258工作液須覆蓋全部被檢細(xì)胞)，37℃避光放置15-20min或室溫靜置20～30min。

5.吸去Hoechst 33258工作液，加入2ml滅菌超純水洗滌三次，直接風(fēng)干。風(fēng)干后加入一滴封片液，并以蓋玻片覆蓋。

6.熒光顯微鏡觀察。用紫外激發(fā)光激發(fā)，觀察細(xì)胞周圍是否有藍(lán)色熒光小點(diǎn)或串珠狀熒光小點(diǎn)。

懸浮細(xì)胞：

1.收集需檢測(cè)的細(xì)胞，1500rpm，5min。

2.將收集的細(xì)胞涂片于載玻片上，再加1ml的固定液，靜置20min。

3.吸去固定液，晾干。

4.于每孔中，加入1ml的Hoechst33258工作液(Hoechst 33258工作液須覆蓋全部被檢細(xì)胞)，37℃避光放置15～20min或室溫靜置20～30min。

5.吸去Hoechst 33258工作液，用無(wú)菌水洗滌玻片3次，直接風(fēng)干。風(fēng)干后加入一滴封固液，并以蓋玻片覆蓋。

6.熒光顯微鏡觀察。用紫外激發(fā)光激發(fā)，觀察細(xì)胞周圍是否有藍(lán)色熒光小點(diǎn)或串珠狀熒光小點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無(wú)菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大小；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過(guò)夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

血管緊張轉(zhuǎn)化2(ACE2)英文名：ACE2 芳香烴受體抗體包裝5g

血管緊張轉(zhuǎn)化(ACE)英文名：ACE 吸引抗體包裝1g

血管緊張?jiān)?/span>(aGT)英文名：aGT 腺苷三磷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1抗體包裝5g

血管緊張Ⅱ受體2(AT2R)英文名：AT2R 蛋白激B2包裝1g

血管緊張Ⅱ(ANG-Ⅱ)英文名：ANG-Ⅱ 血管生成2抗體包裝25g

血管緊張Ⅰ(Ang-Ⅰ)英文名：Ang-Ⅰ 芳香化/色P450/雌激合成抗體包裝5g

血管緊張1-7(Ang1-7)英文名：Ang1-7 腺苷A2A受體抗體包裝1g

血管活性腸肽(VIP)英文名：VIP 蛋白激A錨定蛋白95抗體包裝25g

溴脫氧核苷(BrdU)英文名：BrdU 頂膜鈉依賴性膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白抗體包裝5g

雄烯二(ASD)英文名：ASD 去整合樣金屬蛋白8抗體包裝10MG

雄激受體(AR)英文名：AR 芳香乙酰脫乙酰基樣蛋白3抗體包裝50MG

性激結(jié)合球蛋白(SHBG)英文名：SHBG ACN9蛋白抗體包裝250mg

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子7(Smad7)英文名：Smad7 雙鏈RNA腺苷脫基抗體（N端）包裝50MG

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子1(Smad1)英文名：Smad1 腺苷單磷活化蛋白激α2抗體包裝5g

新生狀腺(NN-T4)英文名：NN-T4 腺苷激抗體包裝25mg

肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白DOC6抗體白介4(IL4)Pritelivir (BAY 57-1293) is a potent helicase primase inhibitor, exhibiting anti
支原體檢測(cè)試劑盒佩特曲霉環(huán)磺酰MEK激

膠孢 2-乙基吡MEST

美麗短芽孢桿 1-萘酸microRNA-210

奇異球反式-鄰溴肉桂Spondin-2；mindin

根瘤 1-溴-3,4,5-三氟苯MRP-14

紅曲紅曲 4-溴-3-甲基吡唑腎上腺髓質(zhì)前體中段肽

短桿狀馬賽 4-甲酸叔丁酯MxA蛋白

傘枝犁頭霉 2,5-二溴對(duì)苯二甲酸NADH-色b5還原

摩洛哥芽孢桿 4--6-乙基-5-氟嘧啶Na-K-ATP

囊孔附毛 L-(+)-扁桃酸乙酯nectin-4

膠孢環(huán)己基雙苯膦氧化物NOD樣受體1

黑曲霉 N,N'-(4,4'-亞甲基二苯基)雙馬來(lái)酰亞NOD樣受體-2

*蟲擬蠟鄰甲基三氟甲苯跨膜受體蛋白Notch-1

瓦克青霉二丁基二硫代氨酸鋅N端前腦鈉

印度不動(dòng)桿 2,4,5-基噻唑N端中段骨鈣
操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度（如無(wú)570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測(cè)試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無(wú)細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無(wú)細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對(duì)照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)