AnnexinV-APC/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒-上海撫生實業(yè)有限公司

貨號	FS-X9627

英文名稱：Annexin V-APC/7-AAD Apoptosis Detection Kit

產(chǎn)品規(guī)格：20T

貨號：FS-X9627

產(chǎn)品介紹:

Annexin V-APC/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒是用熒光素APC標記的Annexin V作為探針，來檢測細胞早期凋亡的發(fā)生，可用流式細胞儀或其他熒光檢測設(shè)備進行檢測。

其檢測原理為：在正常的活細胞中，磷脂酰絲氨suan（phosphotidylserine，PS）位于細胞膜的內(nèi)側(cè)，但在早期凋亡的細胞中，PS從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中。Annexin-V（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36KD的Ca2+ 依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合。可通過細胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨suan與凋亡早期細胞的胞膜結(jié)合。

另外，本試劑盒中提供的7-AAD可用來區(qū)分存活的早期細胞和壞死或晚期凋亡細胞。7-AAD是一種核酸染料，同PI有著相似的熒光特性，但其發(fā)射光譜較PI窄，對其他檢測通道的干擾更小，在多色熒光分析中是PI的佳替代品，可與Annexin V聯(lián)合使用。該染料不能透過正常細胞或早期凋亡細胞的完整的細胞膜，但可穿透晚期凋亡細胞或者壞死細胞并與其內(nèi)的DNA結(jié)合。因此將Annexin V-APC與7-AAD聯(lián)合使用時，7-AAD則被排除在活細胞（Annexin V-/7-AAD-）和早期凋亡細胞（Annexin V+/7-AAD-）之外，而晚期凋亡細胞和壞死細胞同時被Annexin V-APC和7-AAD結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽性（Annexin V+/7-AAD+）。

試劑盒組份：

重組人Annexin V/APC*（rh Annexin V/APC）———100μl

7-AAD Viability Staining Solution——————100μl

1×Binding buffer——————————————10ml

儲存條件：4℃，有效期一年。

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時；

4．將經(jīng)過計數(shù)的細胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當貼壁細胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進行快速固定以及免疫細胞化學檢測。

實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大小；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；

2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；

5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細胞100μL/孔，通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細胞（具體每孔所用的細胞的數(shù)目，需根據(jù)細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育適當時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細胞的OD 值，C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)

維生suB2(VB2)elisa檢測試劑盒英文名稱：VB2 ELISA Kit，VB2，

鐵-過氧化物岐化mei(Fe-SOD)elisa檢測試劑盒英文名稱：Fe-SOD ELISA Kit，F(xiàn)e-SOD，

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Embigin蛋白(EMB)elisa檢測試劑盒英文名稱：EMB ELISA Kit，EMB，

GPI錨定分子樣蛋白(GML)elisa檢測試劑盒英文名稱：GML ELISA Kit，GML，

Cylindromatosis蛋白(CYLD)elisa檢測試劑盒英文名稱：CYLD ELISA Kit，CYLD，

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B-黑色su瘤抗原5(BAGE5)elisa檢測試劑盒英文名稱：BAGE5 ELISA Kit，BAGE5，

Apelin13蛋白(AP13)elisa檢測試劑盒英文名稱：AP13 ELISA Kit，AP13，

Ⅶ型膠原(COL7)elisa檢測試劑盒英文名稱：COL7 ELISA Kit，COL7，

70kDa熱休克蛋白結(jié)合蛋白1(HSPBP1)elisa檢測試劑盒英文名稱：HSPBP1 ELISA Kit，HSPBP1，

2,3-二磷suan甘油suan(2,3-BPG)elisa檢測試劑盒英文名稱：2,3-BPG ELISA Kit，2,3-BPG，

組蛋白去乙?；?/span>mei3(HDAC3)elisa檢測試劑盒英文名稱：HDAC3 ELISA Kit，HDAC3，

胞漿磷蛋白4(STMN4)elisa檢測試劑盒英文名稱：STMN4 ELISA Kit，STMN4，

白介su28B(IL28B)elisa檢測試劑盒英文名稱：IL28B ELISA Kit，IL28B，

半胱氨suan蛋白mei抑制劑7(CST7)elisa檢測試劑盒英文名稱：CST7 ELISA Kit，CST7，

白介su12A(IL12A)elisa檢測試劑盒英文名稱：IL12A ELISA Kit，IL12A，
AnnexinV-APC/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒金絲桃甙標準品規(guī)格:50mg 英文名稱：Hyperoside

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