細(xì)胞凋亡線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-10)-上海撫生實(shí)業(yè)有限公司

貨號(hào)	FS-X9585

產(chǎn)品介紹:

本試劑盒可應(yīng)用于細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位檢測(cè)。大量的研究表明線粒體與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，其中線粒體跨膜電位（△?）的破壞，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程中早發(fā)生的事件之一，它發(fā)生在細(xì)胞核凋亡特征（染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂）出現(xiàn)之前，一旦線粒體跨膜電位崩潰，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。

本試劑盒采用JC-10 (Enhanced JC-1)一種陽離子脂質(zhì)熒光染料作為檢測(cè)線粒體跨膜電位指示劑。JC-100 可以選擇性地進(jìn)入線粒體，且由于膜電位的增加，其顏色會(huì)發(fā)生從綠色到橙色的可逆性改變。這種特性是由于JC-100 聚合物的可逆結(jié)構(gòu)，在膜極化條件下，它的發(fā)射光由520nm(JC-100 單體發(fā)射光)轉(zhuǎn)移到570nm (J-聚合體發(fā)射光)。當(dāng)在490nm 處激發(fā)時(shí)，JC-100 發(fā)生從綠色到橙綠色的可逆改變。這兩種顏色都可以被流式細(xì)胞儀上裝好的一般濾光器檢測(cè)到，因此綠色發(fā)射光可以通過熒光通道1（FL1）進(jìn)行分析，橙綠色發(fā)射光可以通過熒光通道2（FL2）進(jìn)行分析。它除了有潛力用于流式細(xì)胞術(shù)，也可以用于熒光成像分析。

注意事項(xiàng)

1. 微量試劑取用前請(qǐng)離心集液。

2. JC-10 避光保存及使用。

3. 細(xì)胞培養(yǎng)至匯合度80-90%，收集細(xì)胞量在1×106/Test。

4. 對(duì)PH 變化過于敏感的細(xì)胞建議用胎牛血清取代Buffer 孵育染色及洗滌，或延長觀測(cè)時(shí)間。

5. 流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位變化受到多種因素的影響，因誘導(dǎo)劑、細(xì)胞株類型，作用時(shí)間的不同而熒光強(qiáng)度比例都有不同，因此沒有通用標(biāo)準(zhǔn)的補(bǔ)償設(shè)門指南，因此每個(gè)試驗(yàn)需設(shè)陰性及陽性對(duì)照組進(jìn)行熒光補(bǔ)償及設(shè)門。

6. 組織需先制備單細(xì)胞懸液或提取純化線粒體后方可進(jìn)行檢測(cè)，可選用我司細(xì)胞懸液制備試劑盒或線粒體提取試劑盒。

中文名稱：細(xì)胞凋亡線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-10)

英文名稱：JC-10 Apoptosis Detection Kit

產(chǎn)品規(guī)格：10T|20T|50T|100T

貨號(hào)：FS-X9585

實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大??；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長處檢測(cè)每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測(cè)試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對(duì)照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個(gè)平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時(shí)；

4．將經(jīng)過計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時(shí)，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。

骨鈣su(OC)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：OC ELISA Kit，OC，

古梅斯蛋白2(AMZ2)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：AMZ2 ELISA Kit，AMZ2，

干擾suγ誘導(dǎo)單核因子(MIγ)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：MIγ ELISA Kit，MIγ，

甘油磷suan二酯磷suan二酯mei1(GDE1)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：GDE1 ELISA Kit，GDE1，

鈣黏蛋白8(CDH8)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：CDH8 ELISA Kit，CDH8，

弗林蛋白mei(FUR)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：FUR ELISA Kit，F(xiàn)UR，

膜聯(lián)蛋白A4(ANXA4)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：ANXA4 ELISA Kit，ANXA4，

磷脂meiA1(PLA1)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：PLA1 ELISA Kit，PLA1，

硫氧還蛋白1(SRXN1)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：SRXN1 ELISA Kit，SRXN1，

淋巴毒suβ受體(LTβR)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：LTβR ELISA Kit，LTβR，

酪蛋白激mei1δ(CSNK1δ)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：CSNK1δ ELISA Kit，CSNK1δ，

人抗載脂蛋白抗體(AAHA)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：AAHA ELISA Kit，AAHA，

人抗Jo1抗體(Anti-Jo1)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：Anti-Jo1 ELISA Kit，Anti-Jo1，

腈水解mei2(NIT2)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：NIT2 ELISA Kit，NIT2，

窖蛋白(CAV1)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：CAV1 ELISA Kit，CAV1，

性鞘磷脂磷suan二酯mei(Alk-Smase)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：Alk-Smase ELISA Kit，Alk-Smase，

jia基CpG結(jié)合蛋白2(MECP2)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：MECP2 ELISA Kit，MECP2，
細(xì)胞凋亡線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-10)鹽suan酚芐明標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:250mg 英文名稱：Phenoxybenzamine Hydrochloride

L-ben丙氨suan標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：L-Phenylalanine

jialv滅suan鈉標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:500mg 英文名稱：Meclofenamate Sodium

乙二an四乙suan二鈉鹽標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Edetate Disodium

糖精鈣標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:100mg 英文名稱：Saccharin Calcium

酒石suan鉀鈉標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:2g 英文名稱：

鹽suan普莫卡因標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:500mg 英文名稱：Pramoxine Hydrochloride

磺an磺an標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:5g 英文名稱：Sulfanilamide

磺an熔點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)物標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:500mg 英文名稱：

lv貝丁酯標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:1g 英文名稱：Clofibrate