Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒-上海撫生實業(yè)有限公司

貨號	FS-X9533

產品介紹:

本試劑盒是用FITC標記的重組人Annexin V來檢測細胞凋亡時出現(xiàn)在細胞膜表面的磷脂酰絲氨suan的一種細胞凋亡檢測試劑盒?？梢允褂昧魇郊毎麅x、熒光顯微鏡或其它熒光檢測設備進行檢測。一個包裝的本試劑盒共可以檢測20個細胞樣品。

試劑盒組份：

Annexin V-FITC——————100μl

Annexin V-FITC結合液———12ml

碘化丙啶染色液——————220μl

Annexin是一類廣泛分布于真核細胞細胞漿內鈣離子依賴的磷脂結合蛋白，參與細胞內的信號轉導。但僅Annexin V被報道可以調控一些PKC的活性。

Annexin V選擇性結合磷脂酰絲氨suan(phosphatidylserine，簡稱PS)。磷脂酰絲氨suan主要分布在細胞膜內側，即與細胞漿相鄰的一側。在細胞發(fā)生凋亡的早期，不同類型的細胞都會把磷脂酰絲氨suan外翻到細胞表面，即細胞膜外側。磷脂酰絲氨suan暴露到細胞表面后會促進凝血和炎癥反應。而Annexin V和外翻到細胞表面的磷脂酰絲氨suan結合后可以阻斷磷脂酰絲氨suan的促凝血和促炎癥反應活性。

用帶有綠色熒光的熒光探針FITC標記的Annexin V，即Annexin V-FITC，就可以用流式細胞儀或熒光顯微鏡非常簡單而直接地檢測到磷脂酰絲氨suan的外翻這一細胞凋亡的重要特征。

本試劑盒還提供了碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)染色液，碘化丙啶可以染色壞死細胞或凋亡晚期喪失細胞膜完整性的細胞，呈現(xiàn)紅色熒光。對于壞死細胞，由于細胞膜的完整性已經喪失，Annexin V-FITC可以進入到細胞漿內，與位于細胞膜內側的磷脂酰絲氨suan結合，從而也使壞死細胞呈現(xiàn)綠色熒光。

本試劑盒的流式檢測效果參考圖1和圖2，熒光顯微鏡檢測效果參考圖3。

1.細胞用本試劑盒染色后流式細胞儀檢測細胞凋亡的效果圖。Jurkat細胞未經處理(A)或用10μM(Camptothecin)作用4小時(B)后，用本試劑盒染色，然后用流式細胞儀進行細胞的散射和熒光檢測。從圖中可以看出，經過凋亡誘導劑處理后的細胞，其Annexin V-FITC染色陽性并且PI染色陰性的細胞，即凋亡細胞，明顯增加(B圖的右下象限)，Annexin V-FITC和PI染色雙陽性的細胞，即壞死細胞，也有所增加(B圖的右上象限)。圖中Annexin V-FITC染色陰性PI染色陽性(Annexin V-/PI+)所在象限(A和B圖的左上象限)出現(xiàn)的細胞點是許可范圍內的檢測誤差。實測數(shù)據(jù)可能會因細胞類型、細胞凋亡情況、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。

2.細胞用本試劑盒染色后流式細胞儀檢測效果驗證圖。Jurkat細胞用10μM(Camptothecin)作用4小時后，未經染色(A)、僅用本試劑盒中的PI進行染色(B)、僅用本試劑盒中的Annexin V-FITC進行染色(C)、用本試劑盒中的Annexin V-FITC和PI進行雙染(D)。從圖中可以看出，未經染色的是雙陰性細胞(A)，僅PI染色后出現(xiàn)了預期的PI染色陽性的細胞，僅Annexin V-FITC染色出現(xiàn)了預期的Annexin V-FITC染色陽性的細胞，Annexin V-FITC和PI雙染出現(xiàn)了預期的僅Annexin V-FITC染色陽性的凋亡細胞和雙陽性的壞死細胞。出現(xiàn)的非預期的細胞點*在許可的誤差范圍內。實測數(shù)據(jù)可能會因細胞類型、細胞凋亡情況、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。

儲存條件：4℃避光，有效期6個月。

中文名稱：Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒

英文名稱：Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit

產品規(guī)格：20次|50次

貨號：FS-X9533

實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大?。?/span>

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；

2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；

5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細胞100μL/孔，通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細胞（具體每孔所用的細胞的數(shù)目，需根據(jù)細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育適當時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結果分析

a、細胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞），各重復孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細胞的OD 值，C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內20-30 厘米處照射2-3小時；

4．將經過計數(shù)的細胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當貼壁細胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進行快速固定以及免疫細胞化學檢測。

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Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒醉茄粉末提取物標準品規(guī)格:1g 英文名稱：Powdered Ashwagandha Extract

黃tong哌酯相關物質B標準品規(guī)格:20mg 英文名稱：Flavoxate Related Compound B

L-溶血標準品規(guī)格:350mg 英文名稱：

聚山酯60標準品規(guī)格:2g 英文名稱：Polysorbate 60 (AS)

聚山酯40標準品規(guī)格:2g 英文名稱：Polysorbate 40 (AS)

聚山酯80標準品規(guī)格:2g 英文名稱：Polysorbate 80

聚山酯20標準品規(guī)格:2g 英文名稱：Polysorbate 20

聚氧乙烯硬脂suan酯標準品規(guī)格:1g 英文名稱：Polyoxyl 10 Stearyl Ether

聚氧乙烯硬脂suan酯2標準品規(guī)格:1g 英文名稱：Polyoxyl 2 Stearyl Ether (AS)

聚氧乙烯硬脂suan酯20標準品規(guī)格:1g 英文名稱：Polyoxyl 20 Stearyl Ether (AS)

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