Ki67細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(ICF/FACS法)-上海撫生實(shí)業(yè)有限公司

貨號(hào)	FS-X9608

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個(gè)平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時(shí)；

4．將經(jīng)過計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時(shí)，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。

中文名稱：Ki67細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(ICF/FACS法)

英文名稱：Ki67 cell proliferation Detection Kit

產(chǎn)品規(guī)格：20T

貨號(hào)：FS-X9608

產(chǎn)品介紹:

Ki67 蛋白是細(xì)胞周期相關(guān)的一種核蛋白，主要表達(dá)于細(xì)胞增殖分裂的各個(gè)時(shí)期（G1、S、G2 和M 期），但是在靜息的細(xì)胞（G0 期）中不表達(dá)。Ki67 常用于檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)指數(shù)（免疫組化法利用計(jì)算細(xì)胞總數(shù)中的Ki67 陽性細(xì)胞數(shù)所占比例得到Ki67 指數(shù)）。

Ki67 通常通過標(biāo)記抗Ki67 的抗體（FITC 綠色熒光）和DNA 染料碘化丙啶（PI，紅色）而利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)來實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞周期的檢測(cè)。

操作方法

1. 在適的環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)胞。

2. 除去培養(yǎng)液，用PBS 洗一次。

3. 胰蛋白處理和收集細(xì)胞，離心，（注意1）保證每管細(xì)胞數(shù)在106 個(gè)。

4. 用0.3 ml PBS 輕輕的重懸細(xì)胞, 然后慢慢加入0.7 ml 預(yù)冷的100%乙醇。用1 ml 玻璃移液管小心的混勻。在4°C 至少1h。（注意2）

5. 沉淀細(xì)胞，*吸去上清。

6. 用150 μl PBS/1 % BSA 洗細(xì)胞2 次。

7. 用100μl 抗體孵育液（0.5% Tween-20/1%BSA/PBS）重懸細(xì)胞，加入1ul Ki67 抗體(1μg/106 cells)，室溫孵育1 小時(shí)。

8. 離心收集細(xì)胞，用150μl1% BSA-PBS 洗2 次。

9. 離心收集細(xì)胞，用50μl 抗體孵育液重懸，加1μl (1.5μg/106 cells) 羊抗鼠IgG-FITC，室溫孵育30 分鐘。離心收集細(xì)胞，150μl PBS/ 1 % BSA 洗2 次。

10. 用含有終濃度為10 μg/ml RNase A 和20μg/ml PI 的0.5 ml PBS（pH7.4）重懸細(xì)胞。

11. 避光使細(xì)胞在室溫下孵育20min 后，離心收集細(xì)胞，150μl PBS/ 1 % BSA 洗2 次后，轉(zhuǎn)移至流式檢測(cè)管中重懸。

12. FACS 檢測(cè)或者儲(chǔ)存于4℃。

實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大小；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

人抗乙suan受體抗體(Anti-AChR)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：Anti-AChR ELISA Kit，Anti-AChR，

卷曲同源物9(FZD9)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：FZD9 ELISA Kit，F(xiàn)ZD9，

晶狀體蛋白λ1(CRYλ1)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：CRYλ1 ELISA Kit，CRYλ1，

肽meiD(PEPD)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：PEPD ELISA Kit，PEPD，

絲裂原激活蛋白激mei7(MAPK7)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：MAPK7 ELISA Kit，MAPK7，

suan性葡糖meiα(GαA)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：GαA ELISA Kit，GαA，

絲氨suan/蘇氨suan激mei10(STK10)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：STK10 ELISA Kit，STK10，

受體相互作用絲氨suan蘇氨suan激mei2(RIPK2)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：RIPK2 ELISA Kit，RIPK2，

石蛋白1(STON1)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：STON1 ELISA Kit，STON1，

腎上腺髓質(zhì)su2(ADM2)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：ADM2 ELISA Kit，ADM2，

神經(jīng)調(diào)節(jié)su1(NRG1)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：NRG1 ELISA Kit，NRG1，

殺傷蛋白(KLLN)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：KLLN ELISA Kit，KLLN，

溶血磷脂suan受體3(LPAR3)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：LPAR3 ELISA Kit，LPAR3，

趨化因子C-基元配體2(XCL2)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：XCL2 ELISA Kit，XCL2，

血小板激活因子乙酰水解meiⅠb3(PAFAH1B3)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：PAFAH1B3 ELISA Kit，PAFAH1B3，

性別決定區(qū)Y框蛋白3(SOX3)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：SOX3 ELISA Kit，SOX3，

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體3(VEGFR3)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：VEGFR3 ELISA Kit，VEGFR3，
Ki67細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(ICF/FACS法)呋辛鈉標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Cefuroxime Sodium

托拉塞mi標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Torsemide

琥珀suan多西拉敏標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:300mg 英文名稱：Doxylamine Succinate

鹽suan阿法標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:250mg 英文名稱：Alphaprodine Hydrochloride CII

戊柔比星標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:100mg 英文名稱：Valrubicin

己曲安na德標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Triamcinolone Hexacetonide

三lv蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:400mg 英文名稱：Sucralose

硝zuo尼特標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Nitazoxanide

丙suan標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:125mg 英文名稱：Betamethasone Dipropionate

ben環(huán)丙an相關(guān)物質(zhì)B標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:40mg 英文名稱：
操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測(cè)試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對(duì)照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)