Ad-GFP-LC3B-上海撫生實(shí)業(yè)有限公司

貨號(hào)	FS-X9549

產(chǎn)品屬性：

產(chǎn)品名稱	英文名稱	產(chǎn)品規(guī)格	產(chǎn)品貨號(hào)
Ad-GFP-LC3B	Adenovirus expressing GFP-LC3B fusion protein	1ml\|10×1ml	FS-X9549

產(chǎn)品介紹：

本品是一種可以表達(dá)GFP-LC3B融合蛋白的腺病毒，可以用于感染細(xì)胞或組織后進(jìn)行細(xì)胞自噬(autophagy)的檢測(cè)。

LC3是酵母自噬關(guān)鍵蛋白ATG8在哺乳動(dòng)物中的同源蛋白。LC3初被分析鑒定為microtubule-associated protein 1 light chain 3 。LC3蛋白家族包括LC3A、B、C和GABARAP等亞家族，其中對(duì)于LC3B的研究為廣泛。到目前為止，LC3B被認(rèn)為是細(xì)胞自噬信號(hào)通路為關(guān)鍵的標(biāo)志性蛋白。LC3B是一個(gè)具有125個(gè)氨基酸殘基的蛋白，在蛋白合成后，被Atg4所酶切而失去了C端的22個(gè)氨基酸蛋白，從而暴露出C端的甘氨suan，人們把它命名為胞質(zhì)形式的LC3B I。在細(xì)胞自噬的過(guò)程中，其C端暴露的甘氨suan經(jīng)過(guò)一個(gè)類似泛素化的過(guò)程，以ATG7為E1樣激活酶，以ATG3為E2樣連接酶，以Atg12-Atg5-Atg16復(fù)合物為E3樣連接酶，在C端甘氨suan上共價(jià)連接上磷脂酰而成為L(zhǎng)C3B-PE即LC3B II。與胞質(zhì)定位的LC3B I不同，LC3B II定位于自噬體的內(nèi)膜和外膜上。在自噬體與溶酶體融合后，自噬體外膜上的LC3B II被Atg4所酶切，而自噬體內(nèi)膜上的LC3B II則被溶酶體內(nèi)的蛋白酶所降解。盡管LC3B II比LC3B I的分子量要大，但由于其強(qiáng)的疏水性，在SDS-PAGE電泳時(shí)，LC3B II比LC3B I遷移得更快，其表觀分子量分別為14kD和16kD。在用GFP-LC3B腺病毒感染細(xì)胞后，在非自噬的情況下，熒光顯微鏡下GFP-LC3B以彌散的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中；而在自噬的情況下，熒光顯微鏡下GFP-LC3B則聚集在自噬體膜上，以斑點(diǎn)的形式表現(xiàn)出來(lái)。

自噬是一種在進(jìn)化上高度保守的通過(guò)溶酶體吞噬并降解部分自身組分的細(xì)胞內(nèi)分解代謝途徑。自噬與多種生理功能有關(guān)，在饑餓等不利的環(huán)境條件下，細(xì)胞通過(guò)自噬降解多余或異常的細(xì)胞內(nèi)組分，為細(xì)胞的生存提供能量及原材料，促進(jìn)生物體的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化及對(duì)環(huán)境變化產(chǎn)生應(yīng)答。自噬異常與多種病理過(guò)程如腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、代謝疾病、病原體感染等都有密切關(guān)系。由于細(xì)胞自噬在生理和病理過(guò)程中都有重要作用，自噬已經(jīng)成為細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。

Ad-GFP-LC3B是的重組腺病毒，感染后能夠在靶細(xì)胞中有效表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)和LC3B的融合蛋白，呈現(xiàn)明亮的綠色熒光，可以用于細(xì)胞自噬的檢測(cè)。

腺病毒感染細(xì)胞后為瞬時(shí)表達(dá)，通常不會(huì)與基因組DNA重組，不能用于篩選穩(wěn)定細(xì)胞株。本產(chǎn)品感染體內(nèi)外細(xì)胞后，有效表達(dá)時(shí)間通常不少于7天，不同細(xì)胞和組織的有效表達(dá)時(shí)間有所不同。感染10-14天后融合蛋白的表達(dá)很可能會(huì)大大減弱。

Ad-GFP-LC3B采用了成熟的E1缺陷型重組腺病毒載體系統(tǒng)，感染普通的細(xì)胞后不能進(jìn)行擴(kuò)增和重組，從而可以有效降低本產(chǎn)品在活體生物中的風(fēng)險(xiǎn)。

本產(chǎn)品可以在表達(dá)E1的HEK293A、HEK293等適當(dāng)細(xì)胞中擴(kuò)增。

本產(chǎn)品的滴度≥1×108 pfu/ml，使用時(shí)可以按照108pfu/ml進(jìn)行計(jì)算。如果按照20 MOI感染6孔板的細(xì)胞，每孔50萬(wàn)細(xì)胞計(jì)算，共可以感染10個(gè)孔；如果按照20 MOI感染24孔板的細(xì)胞，每孔10萬(wàn)細(xì)胞計(jì)算，共可以感染50個(gè)孔。如果MOI值提高，則相應(yīng)可以感染的孔數(shù)會(huì)減少；如果MOI值降低，則相應(yīng)可以感染的孔數(shù)會(huì)增加。

儲(chǔ)存條件：-20℃，有效期1～2個(gè)月。

注意事項(xiàng)：

1、本試劑盒僅供科學(xué)研究使用，不可用于診斷或治療。

2、螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋和管內(nèi)壁上的液體離心至管底，避免開蓋時(shí)試劑損失。

3、禁止與其他品牌的試劑混用，否則會(huì)影響使用效果。

4、樣品或試劑被細(xì)菌或真菌污染或試劑交叉污染可能會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果。

5、最好使用一次性吸頭、管、瓶或玻璃器皿，可重復(fù)使用的玻璃器皿必須在使用前清洗并*清除殘留清潔劑。

6、避免皮膚或粘膜與試劑接觸。

7、需長(zhǎng)時(shí)間保存可-20℃避光保存。避免反復(fù)凍融，否則將會(huì)增加空白吸收，從而影響檢測(cè)結(jié)果。最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光。

8、用培養(yǎng)基或 PBS 來(lái)配制待檢測(cè)藥物。如果待測(cè)藥物有還原性，則測(cè)定不含細(xì)胞，僅含有 MTS 的待測(cè)藥物溶液在 490 nm處的空白吸光度。如果該吸光度很小，則可以直接加入 MTS ，如果吸光度相對(duì)較大，則需要除去培養(yǎng)基，并用新鮮培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的 100 μl 培養(yǎng)基和 10 μl MTS 進(jìn)行檢測(cè)。

9、細(xì)胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細(xì)胞。

10、加 MTS 溶液后孵育時(shí)間的長(zhǎng)短根據(jù)細(xì)胞的類型和細(xì)胞的密度等實(shí)驗(yàn)情況而定，對(duì)于大多數(shù)情況孵育 1 小時(shí)即可，白細(xì)胞需要培養(yǎng)較長(zhǎng)時(shí)間。

11、如果不是使用 96 孔板檢測(cè)，MTS 溶液的用量相應(yīng)等比例增加即可。

主要性蛋白(MBP)檢測(cè)試劑盒 forMajorBasicProtein(MBP)

皮膚橋蛋白(DPT)檢測(cè)試劑盒 forDermatopontin(DPT)

絲氨suan蛋白mei抑制蛋白E3(SERPINE3)檢測(cè)試劑盒 forSerpinE3(SERPINE3)

基質(zhì)金屬蛋白mei3(MMP3)檢測(cè)試劑盒 forMatrixMetalloproteinase3(MMP3)

封閉蛋白3(CLDN3)檢測(cè)試劑盒 forClaudin3(CLDN3)

組蛋白乙?；D(zhuǎn)移mei1(HAT1)檢測(cè)試劑盒 forHistoneAcetyltransferase1(HAT1)

神經(jīng)正五聚蛋白受體(NPTXR)檢測(cè)試劑盒 forNeuronalPentraxinReceptor(NPTXR)

細(xì)胞胱硫醚γ裂解mei(CSE)檢測(cè)試劑盒 forCystathionineGammaLyase(CSE)

抗生長(zhǎng)激su抗體(Anti-GHAb)檢測(cè)試劑盒 forAnti-GrowthHormoneAntibody(Anti-GHAb)

正五聚蛋白3(PTX3)檢測(cè)試劑盒 forPentraxin3,Long(PTX3)

NeurabinⅠ蛋白(NRB1)檢測(cè)試劑盒 forNeurabinI(NRB1)

巖藻糖激mei(FUK)檢測(cè)試劑盒 forFucokinase(FUK)

防御suα1(DEFα1)檢測(cè)試劑盒 forDefensinAlpha1,Neutrophil(DEFa1)

朊病毒蛋白(PRNP)檢測(cè)試劑盒 forPrionProtein(PRNP)

S100鈣結(jié)合蛋白A6(S100A6)檢測(cè)試劑盒 forS100CalciumBindingProteinA6(S100A6)

抑瘤suM受體(OSMR)檢測(cè)試劑盒 forOncostatinMReceptor(OSMR)

輔肌動(dòng)蛋白α2(ACTN2)檢測(cè)試劑盒 forActininAlpha2(ACTN2)
Ad-GFP-LC3B去氫膽suan標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Dehydrocholic Acid

普伐他汀相關(guān)物質(zhì)B標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:20mg 英文名稱：

伐他汀鈉標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:50mg 英文名稱：Pravastatin Sodium

D-泛chun標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:500mg 英文名稱：Dexpanthenol

克拉霉su有關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:50mg 英文名稱：

克拉霉su標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:100mg 英文名稱：Clarithromycin

克拉霉su鑒別用標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:20mg 英文名稱：Clarithromycin Identity

沙必利標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Cisapride

普伐他汀相關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:15mg 英文名稱：

乳糖chun標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:500mg 英文名稱：Lactitol

操作步驟：

1、貼壁細(xì)胞的消化

①吸除培養(yǎng)液，用無(wú)菌 PBS、Hanks 液或無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞一次，以去除殘余的血清。

②加入少量Trypsin-EDTA solution，略蓋過(guò)細(xì)胞即可，室溫放置 0.5～2min，不同的細(xì)胞消化時(shí)間有所不同。

③顯微鏡下觀察，細(xì)胞明顯收縮，并且肉眼觀察培養(yǎng)器皿底部發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生明顯的變

化；或者用槍吹打細(xì)胞發(fā)現(xiàn)細(xì)胞剛好可以被吹打下來(lái)，吸除細(xì)胞消化液。加入含血清的*細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打下細(xì)胞，即可直接用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

④如果發(fā)現(xiàn)消化不足，則加入 Trypsin-EDTA solution 重新消化。

⑤如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，未及吹打細(xì)胞，細(xì)胞已經(jīng)有部分直接從培養(yǎng)器皿底部脫落，直接用細(xì)胞培養(yǎng)液把細(xì)胞全部吹打下來(lái)。1000～2000g 離心 1min，沉淀細(xì)胞，盡量去除細(xì)胞消化液后，加入含血清的*培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞，即可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2、組織的消化不同的組織需要消化的時(shí)間相差很大，通常以消化后可以充分打散組織為宜。