本品是一種可以表達(dá)mCherry-GFP-LC3B融合蛋白的腺病毒，可以用于感染細(xì)胞或組織后進(jìn)行細(xì)胞自噬的檢測。

LC3是酵母自噬關(guān)鍵蛋白ATG8在哺乳動物中的同源蛋白。LC3初被分析鑒定為microtubule-associated protein 1 light chain 3。LC3蛋白家族包括LC3A、B、C和GABARAP等亞家族，其中對于LC3B的研究為廣泛。到目前為止，LC3B被認(rèn)為是細(xì)胞自噬信號通路為關(guān)鍵的標(biāo)志性蛋白。LC3B是一個具有125個氨基酸殘基的蛋白，在蛋白合成后，被Atg4所酶切而失去了C端的22個氨基酸蛋白，從而暴露出C端的甘氨suan，人們把它命名為胞質(zhì)形式的LC3B I。在細(xì)胞自噬的過程中，其C端暴露的甘氨suan經(jīng)過一個類似泛素化的過程，以ATG7為E1樣激活酶， 以ATG3為E2樣連接酶，以Atg12-Atg5-Atg16復(fù)合物為E3樣連接酶，在C端甘氨suan上共價連接上磷脂酰(phosphatidylethanolamine,PE)而成為LC3B-PE即LC3B II。與胞質(zhì)定位的LC3B I不同，LC3B II定位于自噬體的內(nèi)膜和外膜上。在自噬體與溶酶體融合后，自噬體外膜上的LC3B II被Atg4所酶切，而自噬體內(nèi)膜上的LC3B II則被溶酶體內(nèi)的蛋白酶所降解。盡管LC3B II比LC3B I的分子量要大，但由于其強(qiáng)的疏水性，在SDS-PAGE電泳時，LC3B II比LC3B I遷移得更快，其表觀分子量分別為14kD和16kD。在用GFP-LC3B腺病毒感染細(xì)胞后，在非自噬的情況下，熒光顯微鏡下GFP-LC3B以彌散的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中；而在自噬的情況下，熒光顯微鏡下GFP-LC3B則聚集在自噬體膜上，以斑點的形式表現(xiàn)出來。

自噬是一種在進(jìn)化上高度保守的通過溶酶體吞噬并降解部分自身組分的細(xì)胞內(nèi)分解代謝途徑。自噬與多種生理功能有關(guān)，在饑餓等不利的環(huán)境條件下， 細(xì)胞通過自噬降解多余或異常的細(xì)胞內(nèi)組分，為細(xì)胞的生存提供能量及原材料，促進(jìn)生物體的生長發(fā)育、細(xì)胞分化及對環(huán)境變化產(chǎn)生應(yīng)答。自噬異常與多種病理過程如腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、代謝疾病、病原體感染等都有密切關(guān)系。由于細(xì)胞自噬在生理和病理過程中都有重要作用，自噬已經(jīng)成為細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的一個新的研究熱點。

Ad-mCherry-GFP-LC3B是的重組腺病毒，感染后能夠在靶細(xì)胞中有效表達(dá)紅色熒光蛋白mCherry、綠色熒光蛋白(GFP)和LC3B的融合蛋白，呈現(xiàn)明亮的紅色和綠色熒光，可以用于細(xì)胞自噬的檢測。

自噬小體在與溶酶體融合過程中，溶酶體內(nèi)的酸性環(huán)境會導(dǎo)致GFP熒光淬滅，這為追蹤GFP-LC3B的細(xì)胞定位增加了難度。mCherry是一種來自于蘑菇珊瑚(mushroom coral)的單體紅色熒光蛋白，當(dāng)其與GFP進(jìn)行LC3B的共同標(biāo)記時，在GFP被溶酶體酸性環(huán)境所淬滅的情況下，可以發(fā)出紅色熒光的mCherry因為其的穩(wěn)定性而被保留。因此，通過融合表達(dá)mCherry-GFP-LC3B蛋白，可以非常有效地追蹤自噬過程。在用Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒感染細(xì)胞后，在非自噬的情況下，熒光顯微鏡下mCherry-GFP-LC3B以彌散的黃色熒光(mCherry和GFP的綜合效果)形式存在于細(xì)胞質(zhì)中；而在自噬的情況下，熒光顯微鏡下mCherry-GFP-LC3B則聚集在自噬體膜上，以黃色斑點的形式表現(xiàn)出來(LC3B dot or punctae)；當(dāng)自噬體與溶酶體融合后，因GFP熒光的部分淬滅而以紅色斑點的形式表現(xiàn)出來。

腺病毒感染細(xì)胞后為瞬時表達(dá)，通常不會與基因組DNA重組，不能用于篩選穩(wěn)定細(xì)胞株。本產(chǎn)品感染體內(nèi)外細(xì)胞后，有效表達(dá)時間通常不少于7天，不同細(xì)胞和組織的有效表達(dá)時間有所不同。感染10-14天后融合蛋白的表達(dá)很可能會大大減弱。

本產(chǎn)品可以在表達(dá)E1的HEK293A、HEK293等適當(dāng)細(xì)胞中擴(kuò)增。

本產(chǎn)品的滴度≥1×108 pfu/ml，使用時可以按照108pfu/ml進(jìn)行計算。如果按照20 MOI感染6孔板的細(xì)胞，每孔50萬細(xì)胞計算，共可以感染10個孔；如果按照20 MOI感染24孔板的細(xì)胞，每孔10萬細(xì)胞計算，共可以感染50個孔。如果MOI值提高，則相應(yīng)可以感染的孔數(shù)會減少；如果MOI值降低，則相應(yīng)可以感染的孔數(shù)會增加。

儲存條件：-20℃，有效期1～2個月。

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大??；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。