Hoechst 33258染色液-上海撫生實業(yè)有限公司

貨號	FS-X9671

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時；

4．將經(jīng)過計數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測。

中文名稱：Hoechst 33258染色液

英文名稱：

產(chǎn)品規(guī)格：1mL

貨號：FS-X9671

產(chǎn)品介紹:

Hoechst 33258，也稱bisBenzimide H 33258或HOE 33258，是一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料，對細(xì)胞的毒性較低。Hoechst 33258染色常用于細(xì)胞凋亡檢測，染色后用熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞儀檢測。Hoechst 33258也常用于普通的細(xì)胞核染色，或常規(guī)的DNA染色。Hoechst 33258的大激發(fā)波長為346nm，大發(fā)射波長為460nm;Hoechst 33258和雙鏈DNA結(jié)合后，大激發(fā)波長為352nm，大發(fā)射波長為461nm。本Hoechst 33258染色液可直接用于固定細(xì)胞或組織的細(xì)胞核染色，也可直接用于活細(xì)胞或組織的細(xì)胞核染色。

使用說明：

使用前用生理鹽水或PBS將Hoechst 33258染色液稀釋100倍，即為工作液。

1. 對于固定的細(xì)胞或組織：

a. 對于細(xì)胞或組織樣品，固定后，適當(dāng)洗滌去除固定劑。隨后如果需要進行免疫熒光染色，則先進行免疫熒光染色，染色完畢后再按后續(xù)步驟進行Hoechst 33258染色。如果不需要進行其它染色，則直接進行后續(xù)的Hoechst 33258染色。

b. 對于貼壁細(xì)胞或組織切片，加入少量Hoechst 33258工作液，覆蓋住樣品即可;對于懸浮細(xì)胞，至少加入待染色樣品3倍體積的工作液，混勻。室溫放置3-5分鐘。

c. 吸除Hoechst 33258染色液，用TBST、PBS或生理鹽水洗滌2-3次，每次3-5分鐘。

d. 直接在熒光顯微鏡下觀察或封片后熒光顯微鏡下觀察。細(xì)胞發(fā)生凋亡時，會看到凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染。

2. 對于活細(xì)胞或組織：

a. 加入適當(dāng)量Hoechst 33258工作液，必須充分覆蓋住待染色的樣品，通常對于六孔板一個孔需加入1mL工作液，對于96孔板一個孔需加入100μL工作液。

b. 在適宜于細(xì)胞培養(yǎng)的溫度下培養(yǎng)20-30分鐘。棄染色液，用PBS或培養(yǎng)液洗滌2-3次即可進行熒光檢測。

儲存條件：-20℃避光，有效期一年。

實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大?。?/span>

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

腫瘤相關(guān)抗原(TAA)elisa檢測試劑盒英文名稱：TAA ELISA Kit，TAA，

脂質(zhì)運載蛋白2(LCN2)elisa檢測試劑盒英文名稱：LCN2 ELISA Kit，LCN2，

增殖誘導(dǎo)配體(APRIL)elisa檢測試劑盒英文名稱：APRIL ELISA Kit，APRIL，

游離雌三chun(FE3)elisa檢測試劑盒英文名稱：FE3 ELISA Kit，F(xiàn)E3，

乙酰(ACH)elisa檢測試劑盒英文名稱：ACH ELISA Kit，ACH，

胰蛋白mei原激活肽(TAP)elisa檢測試劑盒英文名稱：TAP ELISA Kit，TAP，

血小板性蛋白(PBP/CXCL7)elisa檢測試劑盒英文名稱：PBP/CXCL7 ELISA Kit，PBP/CXCL7，

血管性血友病因子/瑞斯托霉su輔因子(VWF)elisa檢測試劑盒英文名稱：VWF ELISA Kit，VWF，

Sestrin2蛋白(SESN2)elisa檢測試劑盒英文名稱：SESN2 ELISA Kit，SESN2，

Penguin蛋白(PEN)elisa檢測試劑盒英文名稱：PEN ELISA Kit，PEN，

Rhotekin2蛋白(RTKN2)elisa檢測試劑盒英文名稱：RTKN2 ELISA Kit，RTKN2，

N-去乙?；痬ei/磺基轉(zhuǎn)移mei2(NDST2)elisa檢測試劑盒英文名稱：NDST2 ELISA Kit，NDST2，

Nesprin2蛋白(Nesp2)elisa檢測試劑盒英文名稱：Nesp2 ELISA Kit，Nesp2，

M2-型suan激mei(PKM2)elisa檢測試劑盒英文名稱：PKM2 ELISA Kit，PKM2，

Intersectin1蛋白(ITSN1)elisa檢測試劑盒英文名稱：ITSN1 ELISA Kit，ITSN1，

Genethonin1蛋白(GEN1)elisa檢測試劑盒英文名稱：GEN1 ELISA Kit，GEN1，

D-多巴色su變位mei(DDT)elisa檢測試劑盒英文名稱：DDT ELISA Kit，DDT，
Hoechst 33258染色液外消旋阿巴卡韋標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:20mg 英文名稱：Abacavir Sulfate Racemic

雙-乙基乙氧ben酚jia氧ben基三嗪標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Bemotrizinol

七jia基三硅氧烷標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:150mg 英文名稱：Heptamethyl Trisiloxane

鹽suan莫西沙星標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Moxifloxacin Hydrochloride

美索比妥標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:500mg 英文名稱：Methohexital CIV

黃肉楠標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:20mg 英文名稱：Actein

甘油山崳suan酯標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Glyceryl Behenate

沙丁anchun標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Albuterol

ben丙二chun標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:100mg 英文名稱：Phenylpropanediol

癸氧喹酯標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Decoquinate
操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細(xì)胞，細(xì)胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)