PKH67/PI 雙染細(xì)胞毒性檢測試劑盒是利用細(xì)胞熒光染料PKH67和PI對細(xì)胞進(jìn)行染色，利用PKH67標(biāo)記靶細(xì)胞，PI標(biāo)記死的靶細(xì)胞來區(qū)分不同的細(xì)胞，活的靶細(xì)胞成綠色，死的靶細(xì)胞成紅色和綠色，從而檢測細(xì)胞毒性作用。

根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)，可以用來檢測化合物的細(xì)胞毒性作用。也可以用來檢測殺傷性T 細(xì)胞或NK 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。

熒光染料PKH67是一種可對活細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記的新型染料，可以標(biāo)記活體細(xì)胞，通過與膜結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)分子結(jié)合而標(biāo)記細(xì)胞。對細(xì)胞毒性較小，熒光背景低，脂溶性高，能夠輕易穿透細(xì)胞膜，有著強(qiáng)而穩(wěn)定的綠色熒光。經(jīng)PKH67標(biāo)記的細(xì)胞可用于體外和體內(nèi)增殖研究，且具有不會(huì)使鄰近細(xì)胞染色的功能。

在細(xì)胞分裂增殖過程中，PKH67的熒光強(qiáng)度會(huì)隨著細(xì)胞的分裂而逐級遞減，標(biāo)記熒光可平均分配至兩個(gè)子代細(xì)胞中，因此其熒光強(qiáng)度是親代細(xì)胞的一半，根據(jù)這一特性，它可被用于檢測細(xì)胞增殖，細(xì)胞周期的估算及細(xì)胞分裂等方面。PKH67標(biāo)記細(xì)胞的熒光非常均一，并且分裂后的子代細(xì)胞的熒光分配也更均一。在細(xì)胞分裂增殖過程中，PKH67標(biāo)記熒光可平均分配至兩個(gè)子代細(xì)胞中，熒光強(qiáng)度變?yōu)橛H代細(xì)胞的一半，通過流式細(xì)胞儀根據(jù)熒光強(qiáng)度的不同，可檢測出未分裂細(xì)胞，分裂一次(1/2的熒光強(qiáng)度)，二次(1/4的熒光強(qiáng)度)，三次(1/8的熒光強(qiáng)度)，以及更多分裂次數(shù)的細(xì)胞。PKH67可檢測分裂次數(shù)多達(dá)六次甚至更多。

除了用于細(xì)胞增殖檢測，PKH67 還可以用于細(xì)胞的體外盒體內(nèi)示蹤，標(biāo)記后熒光在胞內(nèi)表達(dá)穩(wěn)定，陽性標(biāo)記率達(dá)98%以上，標(biāo)記細(xì)胞形態(tài)良好，能有效地觀察細(xì)胞在體外的誘導(dǎo)分化情況；或?qū)?biāo)記的細(xì)胞注入體內(nèi)，可以有效的顯示移植細(xì)胞在活體組織中的遷移及分化。

PKH67標(biāo)記的細(xì)胞用于體內(nèi)觀察可以長達(dá)數(shù)周之久，它常被用來做活體細(xì)胞檢測實(shí)驗(yàn)和用熒光電鏡觀察細(xì)胞長期活動(dòng)的實(shí)驗(yàn)。PKH67 毒性較小，不影響細(xì)胞的增殖能力。此方法操作簡單，且不用放射性同位素，不存在安全隱患?？梢愿焖?，更準(zhǔn)確和更安全地得到想要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

PKH67/PI標(biāo)記細(xì)胞后通常用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測。

PKH67標(biāo)記細(xì)胞呈綠色熒光，熒光波長：λex=490 nm,λem=502 nm。流式檢測時(shí)的激發(fā)波長可以選擇488nm，此時(shí)的發(fā)射波長為502nm，使用流式細(xì)胞儀檢測時(shí)可以采用FL1 detection channel。PI標(biāo)記細(xì)胞呈紅色熒光，流式檢測時(shí)的激發(fā)波長可以選擇488nm，此時(shí)的發(fā)射波長為647nm，使用流式細(xì)胞儀檢測時(shí)可以采用FL2 detection channel。

PKH67標(biāo)記的細(xì)胞除了流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞毒性外，還可單染后用于細(xì)胞增殖檢測，或者用熒光酶標(biāo)板定量活細(xì)胞數(shù)目，或者用熒光顯微鏡進(jìn)行均一染色的細(xì)胞示蹤觀察。

儲(chǔ)存條件：-20℃避光保存。

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大??；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。