PKH67細(xì)胞增殖與毒性檢測試劑盒-上海撫生實(shí)業(yè)有限公司

貨號(hào)	FS-X9716

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個(gè)平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時(shí)；

4．將經(jīng)過計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時(shí)，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測。

中文名稱：PKH67細(xì)胞增殖與毒性檢測試劑盒

英文名稱：

產(chǎn)品規(guī)格：500T

貨號(hào)：FS-X9716

產(chǎn)品介紹:

熒光染料PKH67 是一種可對活細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記的新型染料，可以標(biāo)記活體細(xì)胞，通過與膜結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)分子結(jié)合而標(biāo)記細(xì)胞。對細(xì)胞毒性較小，熒光背景低，脂溶性高，能夠輕易穿透細(xì)胞膜，有著強(qiáng)而穩(wěn)定的綠色熒光。經(jīng)PKH67標(biāo)記的細(xì)胞可用于體外和體內(nèi)增殖研究，且具有不會(huì)使鄰近細(xì)胞染色的功能。

在細(xì)胞分裂增殖過程中，PKH67的熒光強(qiáng)度會(huì)隨著細(xì)胞的分裂而逐級(jí)遞減，標(biāo)記熒光可平均分配至兩個(gè)子代細(xì)胞中，因此其熒光強(qiáng)度是親代細(xì)胞的一半，根據(jù)這一特性，它可被用于檢測細(xì)胞增殖，細(xì)胞周期的估算及細(xì)胞分裂等方面。PKH67標(biāo)記細(xì)胞的熒光非常均一，并且分裂后的子代細(xì)胞的熒光分配也更均一。在細(xì)胞分裂增殖過程中，PKH67標(biāo)記熒光可平均分配至兩個(gè)子代細(xì)胞中，熒光強(qiáng)度變?yōu)橛H代細(xì)胞的一半，通過流式細(xì)胞儀根據(jù)熒光強(qiáng)度的不同，可檢測出未分裂細(xì)胞，分裂一次(1/2的熒光強(qiáng)度)，二次(1/4的熒光強(qiáng)度)，三次(1/8的熒光強(qiáng)度)，以及更多分裂次數(shù)的細(xì)胞。PKH67可檢測分裂次數(shù)多達(dá)六次甚至更多。

除了用于細(xì)胞增殖檢測，PKH67 還可以用于細(xì)胞的體外盒體內(nèi)示蹤，標(biāo)記后熒光在胞內(nèi)表達(dá)穩(wěn)定，陽性標(biāo)記率達(dá)98%以上，標(biāo)記細(xì)胞形態(tài)良好，能有效地觀察細(xì)胞在體外的誘導(dǎo)分化情況；或?qū)?biāo)記的細(xì)胞注入體內(nèi)，可以有效的顯示移植細(xì)胞在活體組織中的遷移及分化。

PKH67標(biāo)記的細(xì)胞用于體內(nèi)觀察可以長達(dá)數(shù)周之久，它常被用來做活體細(xì)胞檢測實(shí)驗(yàn)和用熒光電鏡觀察細(xì)胞長期活動(dòng)的實(shí)驗(yàn)。PKH67 毒性較小，不影響細(xì)胞的增殖能力。此方法操作簡單，且不用放射性同位素，不存在安全隱患?？梢愿焖?，更準(zhǔn)確和更安全地得到想要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

PKH67標(biāo)記細(xì)胞后通常用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測。

PKH67標(biāo)記細(xì)胞呈綠色熒光，熒光波長：λex=490 nm,λem=502 nm。

儲(chǔ)存條件：-20℃避光保存。

實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大小；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

肝臟型脂肪結(jié)合蛋白(L-FABP)英文名：L-FABP ADP核糖基化因子結(jié)合蛋白抗體包裝25g

肝細(xì)胞生長因子激活物(HGFAC)英文名：HGFAC ADP核糖基化因子GTP激活蛋白1抗體包裝5g

肝細(xì)胞生長因子(HGF)英文名：HGF ADP核糖基化因子相關(guān)蛋白1包裝250mg

甘油三酯(TG)英文名：TG 琥珀裂解抗體包裝50MG

甘油醛-3-磷脫氫(GAPDH/G3PDH)英文名：GAPDH/G3PDH 精酰tRNA合成抗體包裝25g

甘露糖結(jié)合凝集(MBL)英文名：MBL 真核翻譯起始因子2C3抗體包裝5g

鈣衛(wèi)蛋白(CALP)英文名：CALP 真核翻譯起始因子2C4抗體包裝1g

鈣通道阻滯劑(CCB)英文名：CCB Rho GTP激活蛋白15抗體包裝5g

鈣調(diào)(CAM)英文名：CAM 抑癌基因結(jié)合蛋白ARID1B抗體包裝1g

鈣結(jié)合蛋白(CR)英文名：CR E3連接蛋白ARIH2抗體包裝25g

鈣非依賴型磷脂A2(iPLA2)英文名：iPLA2 ADP核糖基化樣因子1抗體包裝5g

分泌型免疫球蛋白A(sIgA)英文名：sIgA ADP核糖基化因子樣蛋白4抗體包裝1g

分泌型磷脂A2(sPLA2)英文名：sPLA2 肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白2/3抗體包裝5g

肺部活化調(diào)節(jié)趨化因子(PARC/CCL18)英文名：PARC/CCL18 肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白2/3亞型2抗體包裝1g

肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白C(SP-C)英文名：SP-C 肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白2/3亞型4抗體包裝10MG

載脂蛋白1抗體轉(zhuǎn)鐵蛋白(TRF)Nilotinib (AMN-107) is a Bcr-Abl inhibitor with IC50 less than 30 nM in Murine m
PKH67細(xì)胞增殖與毒性檢測試劑盒吉氏芽孢桿硫化鎳(II) (metals basis)核因子κB抑制蛋白α

謝瓦散囊 3,4-嘧啶乙二酸二乙酯黑皮質(zhì)

耐輻射奇球 1-乙基-1,2,4-三唑黑色瘤分化相關(guān)基因5

瘤突曲霉 1-芐氧羰基-4-甲酰黑色瘤相關(guān)抗原1

球孢白僵 N-芐氧羰基-L-絲甲酯黑色

紡錘雷鏈霉 4--2-甲氧基黑色抗體

香菇 2-甲氧基苯基溴化鎂痕量關(guān)聯(lián)受體6

宛氏擬青霉 N-Boc-2-甲酸甲酯橫紋肌輔肌動(dòng)蛋白α

抗生鏈霉 3-苯酰肼紅轉(zhuǎn)酮

蘇云金芽孢桿 (4-甲氧基吡啶-2-基)甲呼吸道合胞病抗原

林生毛霉 4,6-二煙胡蘿卜

產(chǎn)氨短桿 N-苯基乙二花生四烯酸

伯克霍爾德氏 3-基肉桂酸環(huán)孢A

堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿 3-甲硫基乙酸酯環(huán)磷酸鳥苷

枯草芽孢桿 N-芐氧羰基-L-蘇氨芐酯環(huán)
操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)