PCR反應(yīng)的特異性決定因素為:
①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合;
②堿基配對原則;
③Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實性;
④靶基因的特異性與保守性。
其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實性及Taq DNA聚合酶耐高溫性,使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進行,結(jié)合的特異性大大增加,被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū),其特異性程度就更高。
(2) 靈敏度高
PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的,能將皮克(pg=10-12g)量級的起始待測模板擴增到微克(ug=10-6g)水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞;在病毒的檢測中,PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位);在細菌學(xué)中小檢出率為3個細菌。
(3) 簡便、快速
PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶,一次性地將反應(yīng)液加好后,即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應(yīng),一般在2~4 小時完成擴增反應(yīng)。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析,不一定要用同位素,無放射性污染、易推廣。
(4) 對標(biāo)本的純度要求低
不需要分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞,DNA 粗制品及總RNA均可作為擴增模板。可直?
參數(shù)規(guī)格:
產(chǎn)品名稱:淡豆豉探針法PCR鑒定試劑盒規(guī)格
英文名稱:Semen sojae preparatum
貨號:YSP8957
產(chǎn)品規(guī)格:50次
產(chǎn)品運輸:低溫運輸
產(chǎn)品保存:-20℃保存
產(chǎn)品有效期:一年
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實驗過程:
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2.對應(yīng)目的基因的特異引物(在PCR反應(yīng)中,新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制,而不能從無到有,憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物。可以是DNA也可以是RNA,一般20多bp,需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此,擴增不同的基因需要設(shè)計不同的引物)
3.10×PCR Buffer
4.2mM dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5.Taq酶
二、操作步驟
1.在冰浴中,按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer 5μl
dNTP mixl 4μl
引物1(10pM) 2μl
引物2(10PM) 2μ
Taq酶(2U/μl) 1μl
DNA模板(50ng-1μg/μl) 1 μl
加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋,不加或添加石蠟油。
2.調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心,立即置PCR儀上,執(zhí)行擴增。一般:在93℃預(yù)變性3-5min,進入循環(huán)擴增階段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循環(huán)30-35次,后在72℃ 保溫7min。
3.結(jié)束反應(yīng),PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4.PCR的電泳檢測:如在反應(yīng)管中加有石蠟油,需用100μlLuFang進行抽提反應(yīng)混合液,以除去石蠟油;否則,直接取5-10μl電泳檢測
三、注意事項
1.PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進行。好設(shè)立一個的PCR實驗室。
2.純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有影響。一般而言,只要能夠得到可靠的結(jié)果,純化的方法越簡單越好。
3.所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
0.1%蛋白胨水氧化鎂(輕質(zhì))AR碳酸鈣(分析純)anti- CYFIP2 antibody
anti- cygb antibody
PH7.0的NaCl蛋白胨緩沖液Oil Red O 油紅O(蘇丹紅)硫酸銨anti- CYLC2 antibody
anti- CYLD antibody
PH6.8酸鹽緩沖液Oil Red O 油紅O(蘇丹紅)異辛酸anti- CYP11A1 antibody
anti- CYP11B2 antibody
含225mlEC肉湯均質(zhì)袋AEC 3--9-基咔唑 Sigma改性氧化鎂anti- CYP17A1 antibody
anti- CYP19A1 antibody
含225ml堿性蛋白胨水均質(zhì)袋Solvent Blue 38 溶劑藍 38 改性氧化鎂anti- CYP1A1 antibody
anti- CYP1A2-Specific antibody
含225ml蒸餾水均質(zhì)袋Rifampicin 利福平重質(zhì)氧化鎂anti- CYP1B1 antibody
anti- CYP20A1 antibody
含250mlPreston肉湯均質(zhì)袋(雙料)Rifampicin 利福平可再分散性乳膠粉(RDP)anti- CYP24A1 antibody
anti- CYP26B1 antibody
MUG快速鑒定大腸試劑Rifampicin 利福平二醇單醚(二醇醚)anti- CYP27A1 antibody
anti- CYP27A1 antibody
MIU培養(yǎng)基Rifampicin 利福平 Sigma1,4-二蒽醌anti- CYP27A1 antibody
anti- CYP2A6 antibody
MUG快速鑒定大腸試劑Rifampicin 利福平 Sigma氧化鎂anti- CYP2C8 antibody
anti- CYP2D6 antibody
淡豆豉探針法PCR鑒定試劑盒規(guī)格腸道菌增菌肉湯EE 肉湯Enterobacteria Enrichment Broth Mossel十七烷 AR,95.0%sE-selectin ELISA Kit 大鼠可溶性E選擇素LPS-EB Biotin
甘露醇瓊脂Mannitol Salt Agar十五烷 standard for GC, ≥99.5% (GC)Serpina3g(Human serine/cysteine peptidase inhibitor clade A member 3G) ELISA Kit 人絲氨酸蛋白酶抑制因子肽酶抑制因子進化枝3GFLA-ST Ultrapure
兔血漿檸檬酸鈉Rabbit Plasma十五烷 99%sEPCR(Mouse soluble endothelial protein C receptor) ELISA Kit 小鼠可溶性血管內(nèi)皮細胞蛋白C受體Rec FLA-ST
連四硫酸鹽肉湯培養(yǎng)基基礎(chǔ)Fluid Tetrathionate Medium Base十五烷 98%sEPCR(Human soluble endothelial protein C receptor) ELISA Kit 人可溶性血管內(nèi)皮細胞蛋白C受體FLA-ST Ultrapure
溶液十五烷 分析標(biāo)準(zhǔn)品,≥99.8% (GC)sEPCR ELISA Kit 大鼠可溶性血管內(nèi)皮細胞蛋白C受體FLA-PA Ultrapure
0.1%煌綠溶液地塞米松酸鈉 98%sEPCR (Rabbit soluble endothelial protein C receptor) ELISA Kit 兔子可溶性血管內(nèi)皮細胞蛋白C受體FLA-BS Ultrapure
亮綠瓊脂培養(yǎng)基Brilliant Green-Agar Medium潑尼松 98%SEP1(Human selenoprotein 1) ELISA Kit 人硒蛋白1Rec FLA-ST
木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂Xylose lysine Desoxycholate Agar正醛 standard for GC,>99.5%(GC)SE(Human staphylococcus aureus enterotoxins) ELISA Kit 人金葡菌腸毒素FLA-BS
HE 瓊脂培養(yǎng)基Hektoen Enteric Agar Medium正醛 AR,98.5%SDPR(human serum deprivation response) ELISA Kit 人血清剝奪反應(yīng)相關(guān)蛋白FLA-ST
三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基Triple Sugar-Iron-Agar Medium正醛 CP,98%SDH(Human sorbitol dehydrogenase) ELISA Kit 人山梨醇脫酶CL264
適用范圍【參考值】
1.試劑盒有效性判定:
(1)陽性對照:有典型S型擴增曲線或Ct值≤35。
(2)陰性對照:Ct值>38或無Ct值,線形為直線或輕微斜線,無指數(shù)增長期。
2.標(biāo)本結(jié)果判定:
(1)陽性:標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。
(2)可疑:標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值在35~38范圍內(nèi)。此時應(yīng)對標(biāo)本進行重復(fù)檢測,如重復(fù)實驗結(jié)果Ct值仍在35~38范圍內(nèi),有明顯指數(shù)增長期,則判定為陽性,否則為陰性。
(3)陰性:標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值>38或無Ct值。